【摘 要】
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烟草甲Lasioderma serricorne是在世界范围内发生极为普遍的害虫。烟草甲主要在粮仓及经济作物仓库中发生,该虫主要取食烟草、大豆、茶叶、油料等作物,严重影响仓储物的质量。仓库中温度的变化,会促进烟草甲体内一种特殊蛋白质行使功能,协助烟草甲适应仓库中温度变化。这一蛋白即热激蛋白（Heat shock proteins,HSPs）,该蛋白是一类分子伴侣,在昆虫响应温度胁迫中有重要作用。目
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烟草甲Lasioderma serricorne是在世界范围内发生极为普遍的害虫。烟草甲主要在粮仓及经济作物仓库中发生,该虫主要取食烟草、大豆、茶叶、油料等作物,严重影响仓储物的质量。仓库中温度的变化,会促进烟草甲体内一种特殊蛋白质行使功能,协助烟草甲适应仓库中温度变化。这一蛋白即热激蛋白（Heat shock proteins,HSPs）,该蛋白是一类分子伴侣,在昆虫响应温度胁迫中有重要作用。目前对烟草甲HSP的研究报道较少。本文通过检索转录组数据库,鉴定13个烟草甲HSPs基因,分析了HSPs的序列特征和表达模式,取其中2个小分子量HSPs进行功能分析。实验结果如下:1.烟草甲HSPs基因的鉴定与分析通过检索课题组前期构建的烟草甲转录组,获得13个HSPs基因,包括3个HSP90s（Ls HSP90-1、Ls HSP90-2、Ls HSP90-3）、6个HSP70s（Ls HSP70-1、Ls HSP70-2、Ls HSP70-3、Ls HSP70-4、Ls HSP70-5、Ls HSP70-6）、1个HSP60和3个小分子热激蛋白（Ls HSP21.0、Ls HSP21.7、Ls HSP21.8）。以上蛋白均被基因编码,含有昆虫HSP的保守结构域,BLAST比对结果显示以上蛋白与其它种鞘翅目昆虫HSPs有较高同源性,系统进化分析结果也显示这些蛋白与鞘翅目HSPs亲缘关系最近。2.烟草甲HSPs基因在不同组织中表达模式分析对烟草甲5龄幼虫不同组织进行处理。Ls HSP21.0、Ls HSP70-3、Ls HSP70-4和Ls HSP70-5均于烟草甲脂肪体内高量表达。Ls HSP21.8则在烟草甲脂肪体、中肠和血淋巴中低量表达。Ls HSP21.7、Ls HSP70-1、Ls HSP70-5和Ls HSP70-6在烟草甲血淋巴中基因表达量处于较高水平。烟草甲的HSP70s组织相对表达量显著的是Ls HSP70-4。3.烟草甲HSPs基因在不同温度条件下表达模式分析设置温度梯度处理烟草甲（0-40℃）,发现烟草甲5龄幼虫Ls HSP21.0、Ls HSP21.7、Ls HSP21.8、Ls HSP60、Ls HSP70-1、Ls HSP70-2、Ls HSP70-3、Ls HSP70-4、Ls HSP70-5、Ls HSP70-6、Ls HSP90-1、Ls HSP90-2和Ls HSP90-3在高温诱导条件下（40℃）表达量均上调。然而,这些基因在温度低于26℃条件下,Ls HSP21.0、Ls HSP21.7、Ls HSP21.8、Ls HSP90-1和Ls HSP90-2表达量均出现显著下调,而Ls HSP70-5表达量基本保持不变,Ls HSP70-1、Ls HSP70-3、Ls HSP70-4和Ls HSP70-6表达量则有一定提升。4.烟草甲HSPs基因的发育期表达模式分析在烟草甲不同发育阶段中,烟草甲s HSPs和HSP70s的表达量均有差异。其中,Ls HSP21.0基因高量表达于烟草甲蛹期,Ls HSP21.7在烟草甲雌性成虫体内有较高表达量,Ls HSP21.8在烟草甲雄性成虫体内高量表达。Ls HSP70-4和Ls HSP70-5主要在烟草甲幼虫阶段表达,而Ls HSP70-3在烟草甲蛹期的表达量处于高水平。其它基因也可以在一定范围内表达。5.烟草甲小分子热激蛋白原核表达与功能分析使用p Cold II表达载体,烟草甲HSP21.7和HSP21.8重组蛋白SDS-PAGE在大肠杆菌Escherichia coli中成功表达且Western blot显示重组蛋白均为可溶性表达。HSP21.8和HSP21.7增强了大肠杆菌细胞对高温的耐受性,表现为50°C高温处理下,过表达HSP21.8和HSP21.7的大肠杆菌的生长速率(OD600吸光值)显著高于转化p Cold II空载体对照组。此外,将高温处理后的菌液涂布于培养平板上,过表达HSP21.7和HSP21.8的大肠杆菌长出的菌落数量也明显多于p Cold II空载体对照组。这一结果表明HSP21.7和HSP21.8具有热保护功能,能够帮助烟草甲抵御高温胁迫。综上所述,本研究通过对烟草甲HSPs基因家族开展研究,明确了这些基因的序列特征、系统进化关系、表达模式以及热保护功能。研究结果不仅有助于深入解析烟草甲耐受高温的分子机制,也可为开发基于基因沉默的烟草甲新型防治方法提供了靶标。
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