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研究背景:肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）占原发性肝癌的75%-85%,是世界范围内最常见的肿瘤之一,在男性中被列为第二致命的恶性肿瘤[1]。大多数HCC患者确诊时已处于晚期,无法行手术治疗[2]。而化疗、放疗等治疗手段疗效较差。在过去的几十年里,HCC患者的5年生存率没有明显改善[3]。不受控制的细胞增殖和转移是临床治疗的主要障碍,也是高死亡率的原因之一。因此,肿瘤进展的关键分子通路的探索对于肿瘤早期生物标志物的确定和新的治疗药物研发是十分重要的。线粒体作为一种重要的细胞应激传感器,通过氧化磷酸化系统产生三磷酸腺苷（ATP）和活性氧（ROS）等一系列活动[4]。线粒体是哺乳动物细胞中重要的能量产生和细胞稳态的细胞器。线粒体网络的健康对于生命过程中应对各种生理反应及压力刺激至关重要[5][6]。线粒体在肿瘤发生发展中的作用目前引起广泛的关注,但仍有许多未解决的问题。目前越来越多的证据支持线粒体自噬失调与肿瘤的发生密切相关[6]。通过RNA逆转录相关捕获测序（RNA-seq）技术寻找参与HCC异常关键的调节因子,本研究发现细胞核编码的早期生长应答蛋白1（early growth response protein 1,EGR1）在肝癌细胞的线粒体中富集。EGR1是核基因组编码的m RNA,在细胞核内参与许多关键的生物过程,特别是对缺血和缺氧的反应。然而,EGR1 m RNA如何穿梭转运进入线粒体,在线粒体中怎样发挥调控作用,并对HCC结局的影响尚未见报道。研究目的:1.揭示存在于细胞核内的EGR1 m RNA在HCC线粒体内富集的原因及发挥作用形式。2.阐明原先被公认为存在于细胞核内的EGR1 m RNA如何调控HCC线粒体功能及机制。3.明确在线粒体内富集的EGR1与HCC发生发展的相关性,及是否可以作为HCC预后判断,疗效评价的新型分子生物标志物,从而为HCC精准治疗提供崭新的研究思路。研究方法:1.在HCC细胞系Hep G2和正常肝细胞系HL7702中进行线粒体的提取,然后进行RNA测序,以发现在HCC和正常肝细胞中差异表达的线粒体RNA。并应用RNA荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization,FISH）及RT-q PCR进一步确证EGR1 m RNA在线粒体中的分布及含量。2.利用免疫荧光（Immunofluorescence,IF）及免疫印迹方法明确EGR1蛋白在HCC细胞中的分布情况及线粒体中EGR1 m RNA发挥作用的形式。3.通过sh RNA稳定干涉EGR1 m RNA的表达,检测对线粒体功能（如ATP产生、ROS、线粒体膜电位等）影响。4.通过透射电镜（TEM）、IF等方法检测EGR1 m RNA对缺氧诱导的线粒体自噬的影响。5.通过免疫印迹、CLIP等方法进一步探究EGR1调控缺氧诱导的线粒体自噬机制。6.通过免疫印迹等方法明确EGR1对自噬体的形成及线粒体动力学的调控作用。7.通过sh RNA的方法敲低EGR1后,应用CCK-8实验、Transwell小室实验、划痕实验和平板克隆形成实验,Annexin V/SYTOX染色,评估EGR1对肿瘤细胞增殖、肿瘤克隆形成能力、肿瘤细胞凋亡、肿瘤细胞迁移、侵袭等的影响。8.改造Lwa Cas13a质粒,通过Lwa Cas13a-BN-MLS靶向线粒体RNA敲除技术,进一步明确靶向线粒体内EGR1 m RNA敲除后对线粒体功能及缺氧诱导的线粒体自噬的影响。研究结果:1.通过线粒体RNA-seq与FISH相结合,本研究发现核基因组编码的EGR1m RNA在HCC线粒体中富集。2.首次发现在HCC中,EGR1 m RNA分子被转运到线粒体中,在那里它们不被翻译成EGR1蛋白。相反,它们作为非编码m RNA分子在线粒体中发挥作用。IF同样证实线粒体中EGR1不翻译为蛋白质。3.通过sh RNA的方法沉默EGR1后,线粒体功能受到明显影响,表现为线粒体ATP生成减少,ROS产生增多,线粒体膜电位降低。4.利用TEM发现,与对照组相比,EGR1敲低组缺氧诱导的自噬溶酶体数量较对照组减少。利用IF发现,EGR1敲低组线粒体自噬发生明显减弱。说明没有EGR1,Hep G2细胞无法完全执行其线粒体自噬功能。5.EGR1作为一种非典型的非编码m RNA分子,在缺氧刺激下协调自噬受体BNIP3和NIX向线粒体膜募集。通过HIF-α/BNIP3/BNIP3L通路调控线粒体自噬。6.与对照组相比,EGR1敲低组自噬受体转运蛋白,包括SQSTM1/p62、optinurin、NDP52及LC3B表达明显降低。线粒体分裂蛋白DRP1表达降低,线粒体融合蛋白MFN1/MFN2及OPA1表达升高。7.通过sh RNA稳定干涉EGR1的表达,发现HCC细胞增殖减慢,迁移及侵袭能力减弱,细胞克隆形成能力减弱,凋亡增加。8.利用斯坦福实验室团队构建的Lwa Cas13a-BN-MLS靶向线粒体方法（相关方法学文章正在投稿中）,在不影响细胞核内EGR1的情况下,特异性敲除了HCC细胞系线粒体内的EGR1。实验结果与整体细胞水平上敲除EGR1的结果基本一致。EGR1在线粒体内靶向敲除后,线粒体ATP生产下降,膜电位下降,活性氧产量增加。在缺氧诱导的线粒体自噬中,与EGR1靶向敲除组相比,Cas13a-Ctrl组细胞中线粒体蛋白COX4降解的更多,提示EGR1是线粒体自噬所必需的。研究结论:1.本研究通过线粒体转录本高通量测序首次鉴定了核基因组EGR1 m RNA相比正常肝细胞HL7702,高度富集在HCC细胞系线粒体中。EGR1 m RNA可以编码一种重要的蛋白分子,能够对应激产生即刻反应。然而在HCC细胞中,部分EGR1 m RNA分子被转移到HCC细胞的线粒体中。本研究首次证明,核基因组编码的EGR1 m RNA除了具有众所周知的肽编码功能的典型途径外,还可能通过非编码m RNA这一非典型通路发挥作用。2.线粒体中EGR1的敲除,无论是用Lwa Cas13a-BN-MLS靶向线粒体RNA还是sh RNA,都能显著抑制肝癌细胞的线粒体自噬。EGR1作为非编码m RNA分子,其3’UTR段与BNIP3蛋白结合,在缺氧刺激下协调自噬受体BNIP3和NIX向线粒体膜募集,通过HIF-α/BNIP3/BNIP3L通路表观调控线粒体自噬,并对线粒体动力学进行调控,表现为促进线粒体分裂,抑制线粒体融合。EGR1的缺失导致受损线粒体的积累,同时伴有线粒体功能障碍,包括ATP生成减少,ROS生成增加,线粒体膜电位降低。EGR1通过细胞核-核糖体-线粒体之间的遗传信息的紧密协调,在维持一个健康的线粒体网络中发挥重要作用。3.EGR1敲低后,HCC的迁移和侵袭能力明显减弱,细胞集落形成明显减少,细胞增殖减慢,凋亡增加,因此,EGR1可能在HCC中起到促进肿瘤发生发展的作用。