橡胶草(Taraxacum kok-saghyz)是菊科蒲公英属多年生的宿根型草本植物,与巴西橡胶树、银胶菊并称为全世界三大产胶植物,其根所产橡胶在结构和性能方面,与巴西橡胶树所产橡胶相当。从橡胶草根中不仅能够提取战略物资——天然橡胶,而且还可以获得清洁能源乙醇和保健品菊糖,是中国最有希望商业开发的第二天然橡胶之一。但是,由于橡胶草作为一种草本产胶植物,含胶量低,且收集难度较大,生产成本较高,限制了它的大规模应用。通过基因工程的方法,提高橡胶草的产胶量,解决橡胶资源短缺具有重要的意义。因此,本研究将橡胶合成相关基因GGPPS导入橡胶草中,改变原有的表达水平,加快橡胶的合成速度,从而提高橡胶产量;另一方面,通过RNAi技术沉默GGPPS基因,研究GGPPS基因在橡胶合成中的作用,为天然橡胶合成机制的研究提供一定的技术支持和理论储备。主要研究内容如下:(1)采用RT-PCR和RACE技术从橡胶草中克隆得到一个GGPPS基因(命名为Tk GGPPS),全长c DNA长为1140bp,编码379个氨基酸;序列分析表明,Tk GGPPS基因属于类异戊二烯超家族成员;氨基酸序列同源性比对与系统进化分析表明,Tk GGPPS与向日葵Ha GGPPS的亲缘关系较近,相似性为74.67%。(2)采用q RT-PCR技术,检测GGPPS在橡胶草不同组织和不同发育时期的表达情况。结果表明:Tk GGPPS基因主要在橡胶草的主根和种子萌发后的第6周的根中表达。另外,Tk GGPPS的表达受茉莉酸甲酯(Me JA)的诱导,且在Me JA浓度为3mmol·L-1时,表达量最大。(3)分别构建Tk GGPPS基因的过表达、Tk GGPPS-RNAi植物表达载体,利用农杆菌介导的方法转化橡胶草,获得转基因橡胶草。经过PCR检测,转Tk GGPPS基因橡胶草共获得5株,转Tk GGPPS-RNAi片段的橡胶草共获得4株。(4)与空白橡胶草相比,过表达株系能够明显地增加根中橡胶的含量和叶片光合色素的含量,而RNAi株系则明显地降低根中橡胶的含量和叶片光合色素的含量。(5)采用qRT-PCR技术,检测转Tk GGPPS基因橡胶草和转Tk GGPPS-RNAi片段的橡胶草中Tk GGPPS基因的相对表达量。结果表明:过表达株系Tk GGPPS基因的表达量均上调,而RNAi株系表达量均下调。(6)构建Tk GGPPS-GFP融合表达载体,利用农杆菌介导的方法转化洋葱表皮细胞,结果表明该基因定位在细胞壁。(7)采用TAIL-PCR方法,扩增得到GGPPS基因5’上游长为1131bp的启动子序列,命名为Pro Tk GGPPS。采用Plant Care软件进行序列分析,表明该序列具有启动子基本顺式作用元件TATA-box和CAAT-box。此外,还有多个光响应元件,如ACE、Box I、ATC-motif等,以及一些与胁迫相关的作用元件,如HSE、ARE和LTRE等。(8)构建p CAMBIA1304-Pro Tk GGPPS-GFP植物表达载体,利用农杆菌介导的方法转化洋葱表皮细胞,结果表明该启动子能够驱动下游报告基因的表达。总之,本研究从橡胶草中克隆获得GGPPS全长基因以及5’上游启动子序列,功能研究表明GGPPS基因具有组织特异性表达的特性,并且与橡胶的生物合成相关。