论文部分内容阅读
RNAi是真核生物在抵御外来病毒侵害过程中产生的,在特定酶参与下对体内的双链RNA(ds RNA)产生识别,并降解特定同源信使RNA(m RNA)的现象。病毒诱导的基因沉默(virus induced gene silencing,VIGS)技术是通过把目标基因整合到病毒的基因组中,在病毒侵染寄主并大量增殖过程中产生大量ds RNA,从而诱导沉默植物病原菌特定m RNA,降低基因的表达,来达到防治病虫害的目的。此外,RNAi是研究生物基因功能的重要工具,有助于鉴定病原菌致病基因和生长发育关键基因,为利用RNAi技术培育抗病虫害植物提供靶基因。本研究室通过ds RNA饲喂方法,发现诱导麦长管蚜水通道蛋白基因(Wsa)基因沉默可以严重影响麦长管蚜的生长和繁殖;利用人工合成ds RNA与小麦全蚀病菌共培养方法筛选出对小麦全蚀菌生长速度影响较大的龙胆酸加双氧酶基因(Gdo)。在此基础上,本研究开展了两部分工作:(1)通过大麦条纹花叶病毒(BSMV)介导的VIGS新技术研究了麦长管蚜水通道蛋白基因(Wsa)对蚜虫生长的影响;(2)利用本实验室构建的发夹RNA载体植物真菌连通RNAi新载体p BHt2-CHSA-Intron做了小麦全蚀病菌的根癌农杆菌遗传转化(Agrobacterium tumefaciens mediated transformation,ATMT),分析了全蚀病菌龙胆酸加双氧酶基因(Gdo)片段的RNAi对全蚀病菌的生长的影响。主要研究内容及结论如下:1.麦长管蚜水通道蛋白基因(Wsa)RNAi效应分析方面:成功把蚜虫水通道蛋白基因(Wsa)连接到BSMV病毒载体中,得到重组质粒。统计分析了穗王126,西农979,中国春3种小麦品种接种BSMV病毒干扰载体后对小麦蚜虫繁殖数量的影响。结果显示中国春对麦长管蚜数量抑制最明显。中国春上麦长管蚜的增殖率下降了68.60%,西农979上麦长管蚜的增值率下降了60.00%,穗王126第25天麦长管蚜的增值率也下降了60.45%。对感病中国春小麦接种麦长管蚜,每隔5天进行统计,蚜虫增长率在第30天被抑制达到30.10%。2.小麦全蚀菌龙胆酸加双氧酶基因(Gdo)RNAi效应分析方面:小麦全蚀病龙胆酸加双氧酶基因(Gdo)RNA干扰载体的构建,合成RNAi新载体有利于和表达载体的连接。通过反向连接把序列相同的两段外源DNA片段接入新建干扰载体p BHt2-CHSA-Intron,并用农杆菌介导的方法转化病原菌,发挥RNA干扰作用。此载体可先在真菌体内验证基因干扰效果,效果明显的可通过酶切连接进植物RNA干扰载体p FGC5941中,再对植物进行转化为植物抗真菌研究提供了很大的方便。通过t测验对比在含有潮霉素B(Hyb)100μg/m L抗性的培养基中共培养全蚀病和非转化的全蚀病菌丝生长直径有显著差异(t=0.037<0.5)。通过候选转化子和非转化子在非抗性PDA培养基中生长直径的比较,经t测验,有1个候选转花子达到了显著水平。不同候选转化子之间也有很大差异,可能与T-DNA插入全蚀病菌基因组DNA的位点不同有关。非转化子的直径增长速度比候选转化子增长速度都快,候选转化子的生长受到抑制。