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刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)是一种呈世界范围分布的人兽共患寄生原虫,给人类生活和畜牧业生产带来极大的危害,迄今免疫预防控制弓形虫病仍未取得突破性进展。目前临床可用的特效药物较少,寻找高效、低毒的新型抗弓形虫药物仍是弓形虫病研究的重要方向之一。类异戊二烯化合物是生物体所必需的,而2C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸(2C-methyl-D-erythritol-4-Phosphate, MEP)途径是一种广泛存在于植物、细菌和多种顶复门原虫的类异戊二烯合成代谢途径,该途径在人和动物体内不存在。1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶(1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate reductoisomerase, DXR)是类异戊二烯代谢的MEP途径中的第二个反应酶,该酶是研制抗菌和抗原虫药物的潜在靶标。本研究根据弓形虫基因组数据库(http://www.toxodb.org)的T.gondii DXR基因序列,进行克隆和原核表达,分析研究了其酶动力学和抑制动力学特征。试验具体分为以下几个部分：首先根据基因组数据库中注释预测的TgDXR的ORF序列设计特异性引物,以弓形虫速殖子总RNA为模版,反转录成cDNA第一链,用PCR方法成功扩增出包含整个ORF的序列片段。TgDXR的ORF全长为1542bp,编码一个由513个氨基酸组成的多肽,理论分子量为55.7kD。信号肽预测和多序列比对结果表明,其N-端包括由22个氨基酸组成的信号肽和43个氨基酸组成的转导肽,成熟的TgDXR蛋白共由448个氨基酸组成,分子量为48.6kD。与其它物种DXR的氨基酸序列相似性在36-63%之间,三维结构分析显示预测的TgDXR单体蛋白中含有的α螺旋,β折叠,β转角和无规则卷曲分别为45.1%,22.9%,8.7%,和23.3%。利用DNA重组技术,选择不同的原核表达载体(pET-32a(+)、pMAL-c2x),利用E.coli Rosseta(DE3)重组表达TgDXR的不同序列片段(TgDXR1:完整的ORF;TgDXR2:不包括信号肽和转导肽的功能片段)。结果显示两个重组载体都能够得到表达；但pET-32a(+)-TgDXR重组表达蛋白以包涵体的形式存在,pMAL-c2x-TgDXR表达蛋白大部分存在于上清中。纯化pMAL-c2x-TgDXR表达的重组蛋白进行酶动力学及抑制动力学分析,结果显示,重组TgDXR(rTgDXR)能够在二价金属离子Mn2+的存在下,氧化NADPH并催化1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸(DXP)产生异构还原生成2C-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸(MEP),实验测得rTgDXR对NADPH的Km值为36.3±3.2μM,对DXP的Km值为11.5±0.8μM。酶抑制动力学显示,抑制剂Fosmidomycin对TgDXR具有明显抑制活性,其对TgDXR的IC50为8.8±0.4μM,提示TgDXR是开发抗弓形虫药物的重要靶标。