CYP1A1是CYP450的一种亚型，其转染活化受到芳香烃受体(AhR)的调控。CYP1A1可氧化代谢多环芳香类化合物(PAHs)，将其代谢为具有基因毒性的一系列的水溶性衍生物，这些衍生物可以接合到DNA结构中，影响DNA的正常功能，从而诱导肿瘤的发生。这类化合物中的TCDD(2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p dioxin)是目前所知CYP1A1最强的诱导剂。　　 临床上，CYP1A1的活化会导致许多不期望发生的药物相互作用和毒副反应。因而人们为了预测和控制CYP1A1的活性，开发了许多方法用以检测CYP1A1在外源化合物作用下的活性，并用以发现CYP1A1的专属诱导剂或抑制剂。荧光素酶报告基因技术就是这些方法较为先进的一种。其基本原理是将一段需要检测的基因的调控序列与表达萤火虫荧光素酶的基因序列接合到一起，然后将这段接合的DNA以质粒的形式导入到细胞中，目标基因的转录活性就会以萤火虫荧光素酶的多少表达出来。报告基因模型相比经典的方法具有无可替代的优势，具有很高的普及性和应用性。　　 因此，本研究的目的是建立和验证CYP1A1荧光素酶报告基因模型，并应用于筛选常见中药，如银杏，丹参，大黄，白花前胡，紫菀等的有效成分对CYP1A1酶基因表达的影响，为研究及预测药物相互作用提供依据。　　 一、人CYP1A1报告基因模型的建立和验证。　　 目的：建立人CYP1A1报告基因模型，为下一步药物诱导及抑制实验提供基础。　　 方法：采用由德国Tubingen大学Peter A.Munzel教授构建的三种质粒，分别为pT81Luc/hCYP1A1-5_wt，pT81/CDEF及pT81/hCYP1a1_3×DRE。并选择来源于人肝的HepG2细胞和来源于人小肠的LS174T细胞做为其载体。应用脂质体Lipofectamine2000将质粒转入细胞。　　 结果：　　 1.通过确定细胞的接种量，脂质体的转染比例，最终确定采用质粒pT81/hCYP1a1_3×DRE建立报告基因模型。　　 2.采用TCDD做阳性对照，通过筛选不同浓度，最终选用10nM做高通量筛选时的阳性对照的浓度。　　 结论：本部分采取简单易行而且高效的方法，通过选择合适的质粒，考查并优化多项指标，成功地在HepG2细胞及LS174T细胞上建立了人CYP1A1报告基因模型。并确定了阳性药物TCDD进行药物诱导实验的最佳浓度，为下一步的筛选实验提供了可靠的基础。　　 二、银杏叶提取物及其它中药单体诱导人CYP1A1基因表达的研究。　　 目的：筛选包括银杏叶提取物，丹参，大黄，前胡，桑白皮，紫苑等常见中药中的单体化合物对CYP1A1基因基础表达的诱导情况。　　 方法：采用之前建立的人CYP1A1报告基因模型，在24孔板或48孔板上接种HepG2细胞或LS174T细胞，12h之后转染pT81/hCYP1a1_3×DRE进细胞，4-6h后按所需的浓度加入待测药物。孵育48h之后通过报告基因检测基因表达。　　 结果：　　 1.银杏叶提取物中的三种萜类化合物银杏内酯A(GA)，银杏内酯B(GB)及白果内酯(BB)在基于HepG2细胞的模型上，与空白对照组比均可抑制CYP1A1的转录活性。三种主要的黄酮类化合物槲皮素(Que)，山萘酚(Kae)，异鼠李素(Iso)则诱导CYP1A1的转录活性。而在基于LS174T细胞的模型上，除银杏内酯B(GB)外均可抑制CYP1A1的转录活性。　　 2.丹参中的六种有效成分丹参酮Ⅰ(TanⅠ)，丹参素钠(SD)，原儿茶醛(Proto)，丹酚酸B(SA-B)，丹参酮ⅡA(TanⅡA)，隐丹参酮(CTan)在基于HepG2细胞的模型上，与空白对照组比均可诱导CYP1A1的转录活性。而在基于LS174T细胞的模型上，均可抑制CYP1A1的转录活性。　　 3.大黄中的大黄素甲醚(Phy)，大黄酸(Rhe)，大黄酚(Chr)在基于HepG2细胞的模型上，均可诱导CYP1A1的转录活性。大黄素(Emo)和芦荟大黄素(Alo)则可抑制CYP1A1的转录活性。而在基于LS174T细胞的模型上，则均可抑制CYP1A1的转录活性。　　 4.白花前胡中的四种有效成分在基于HepG2细胞的模型上，除白花前胡素E(PraE)外，白花前胡甲素(PraA)，白花前胡丙素(PraC)，白花前胡丁素(PraD)均可诱导CYP1A1的转录活性。而在基于LS174T细胞的模型上，除白花前胡甲素(PraA)外均可抑制CYP1A1的转录活性。　　 5.紫苑中的两种有效成分紫苑酮(Shi)和表木栓醇(Epi)，以及桑色素(Mor)，桑皮苷A(Mul)，白藜芦醇(Resveratrol)在基于HepG2细胞的模型上，除桑皮苷A(Mul)外均可诱导CYP1A1的转录活性。而在基于LS174T细胞的模型上，除桑色素(Mor)外均可抑制CYP1A1的转录活性。　　 6.白藜芦醇(Resveratrol)在给予梯度浓度0.01μM，0.1μM，1μM，10μM，100μM的情况下，除0.01μM，0.1μM两个给药组产生了抑制作用，其它三个给药组1μM，10μM，100μM都产生了诱导作用，且呈现明显的剂量依赖性。　　 结论：本部分研究通过之前建立的人CYP1A1报告基因模型，筛选了包括银杏叶提取物，丹参，大黄，白花前胡，紫苑等常见中药中的主要单体，以及桑皮苷A，桑色素，白藜芦醇等，总共25个中药单体化合物。结果表明这些化合物普遍存在诱导或抑制人CYP1A1基因表达的作用。其中诱导作用中较为显著的结果有白藜芦醇(Resveratrol)使转录活性升高到3.60倍。对白藜芦醇不同浓度的筛选表明白其诱导作用呈现剂量依赖性。　　 三、银杏叶提取物及其它中药单体抑制人CYP1A1基因表达的研究。　　 目的：在CYP1A1基因处于诱导高表达的基础上，筛选包括银杏叶提取物，丹参，大黄，前胡，桑白皮，紫苑等常见中药中的各单体化合物对CYP1A1基因表达的抑制情况。　　 方法：采用之前建立的人CYP1A1报告基因模型，在24孔板或48孔板上接种HepG2细胞或LS174T细胞，12h之后转染pT81/hCYP1a1_3×DRE进细胞，4-6h后按所需的浓度加入待测药物。孵育48h之后通过报告基因检测基因表达。　　 结果：　　 1.银杏叶提取物中的槲皮素(Que)，山萘酚(Kae)，异鼠李素(Iso)和白果内酯(BB)在基于HepG2细胞的模型上，可提高CYP1A1的转录活性。而银杏内酯A(GA)和银杏内酯B(GB)可降低CYP1A1的转录活性。而在基于LS174T细胞的模型上，除槲皮素(Que)和银杏内酯A(GA)外，均可提高CYP1A1的转录活性。　　 2.丹参中除丹参素钠(SD)和隐丹参酮(CTan)外，在基于HepG2细胞的模型上，丹参酮Ⅰ(TanⅠ)，原儿茶醛(Proto)，丹酚酸B(SA-B)，丹参酮ⅡA(TanⅡA)均可明显提高CYP1A1的转录活性。而在基于LS174T细胞的模型上，除丹参酮Ⅰ(TanⅠ)和隐丹参酮(CTan)外，均可提高CYP1A1的转录活性。　　 3.大黄中的大黄素(Emo)，大黄酚(Chr)，大黄素甲醚(Phy)，大黄酸(Rhe)，芦荟大黄素(Alo)在基于HepG2细胞的模型上，均可降低CYP1A1的转录活性。而在基于LS174T细胞的模型上，除大黄素(Emo)外，均可提高CYP1A1的转录活性。　　 4.白花前胡中的白花前胡甲素(PraA)，白花前胡丙素(PraC)，白花前胡丁素(PraD)，白花前胡素E(PraE)在基于HepG2细胞的模型上，均可降低CYP1A1的转录活性。而在基于LS174T细胞的模型上，均可提高CYP1A1的转录活性。　　 5.紫苑中的两种有效成分紫苑酮(Shi)和表木栓醇(Epi)，以及桑色素(Mor)，桑皮苷A(Mul)，白藜芦醇(Resveratrol)在基于HepG2细胞的模型上，除桑皮苷A(Mul)和紫苑酮(Shi)外均可提升CYP1A1的转录活性。而在基于LS174T细胞的模型上，均可提升CYP1A1的转录活性。　　 6.大黄素(Emo)在给予梯度浓度0.01μM，0.1μM，1μM，10μM，100μM的情况下，除0.1μM，1μM两个给药组产生了抑制作用，其它三个给药组0.01μM，10μM，100μM都产生了诱导作用，并且在1μM以上的浓度呈现明显的剂量依赖性。　　 结论：本部分研究在前一部分的基础之上，筛选了包括银杏叶提取物，丹参，大黄，白花前胡，紫苑等常见中药中的主要单体，以及桑皮苷A，桑色素，白藜芦醇等，总共25个中药单体化合物对诱导高表达的CYP1A1的基因表达活性的作用。结果表明大部分化合物都能抑制处于高表达状态的人CYP1A1基因转录活性。其中较为显著的结果有大黄素(Emo)使CYP1A1的转录活性降低约70％。　　 综上所述，本研究建立了适合于高通量筛选的人CYP1A1报告基因方法，筛选和研究了包括银杏叶提取物，丹参，大黄，前胡，桑白皮，紫苑等常见中药中的共25个中药单体化合物，对CYP1A1酶基因基础表达和高表达的影响。结果发现白藜芦醇对CYP1A1基因表达有诱导作用，且呈现剂量依赖性；还发现大黄素(Emo)对CYP1A1基因表达有较强的抑制作用。