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铁载体是细菌、真菌等微生物为了应答自然条件下的低铁环境,合成并分泌到胞外摄取铁的一类低分子量(200～2000Da)、高度专一性的铁螯合剂。革兰氏阴性菌假单胞菌(Pseudomonas),是一类具有代谢多样性、分布广泛、种类多样的环境微生物,因其超强的适应力存在于不同的生境中。假单胞菌能够产生多种结构的铁载体,所产铁载体不仅帮助细菌争夺铁,还和细菌致病性有关,对假单胞菌在生物病害防治、医学等领域的研究具有重要意义。因此假单胞菌中发达且精确调控的多铁载体系统,是假单胞菌对环境的强适应力及其具有生存竞争优势的重要因素。东湖假单胞菌(P.donghuensis)HYS菌株是本实验室从中国武汉东湖水域分离并鉴定的一株高产铁载体的假单胞菌,其产铁载体能力是其他假单胞菌的3-4倍。HYS菌株产两种铁载体,pyoverdine和非荧光铁载体,后者经鉴定为7-羟基环庚三烯酚酮(7-hydroxytropolone,7-HT),在HYS菌株中大量产生。本实验室前期工作通过转座子诱变,筛选了 HYS菌株铁载体合成相关基因。orf6-9证实为7-HT合成关键基因,受胞外铁浓度和Gac/Rsm系统调控。7-HT作为一种新的铁载体,具有生物毒性,因此其合成的精确调控必不可少。本工作结合经典的转座子插入诱变、基因敲除、荧光定量和CAS检测等方法,确定了 7-HT合成的遗传基础及相关基因的功能,探究了 7-HT生物合成的可能途径,揭示了其合成的精确调控机理。本研究从以下三个方面开展工作:1.对HYS菌株产7-HT有关的基因进行了确定。为了进一步确定7-HT合成的遗传基础,以pyoverdine合成缺陷株△pvd4为出发菌株,利用转座子诱变的方法,筛选了 7811株接合子,得到15株与△pvdA相比铁载体表型有稳定差异的菌株,结合TAIL-PCR和半随机引物PCR,鉴定突变株涉及9个基因,其中6个基因位于基因簇1上。结合以HYS为出发菌株的筛库结果,确定了基因簇1和基因簇2为HYS菌株铁载体合成基因簇。2.通过基因功能分析,确定基因簇1和基因簇2参与7-HT生物合成,勾画了 7-HT的合成途径。基因簇2为苯乙酸代谢基因簇,与大肠杆菌K12菌株中苯乙酸基因簇编码的蛋白相似度为48%-65%。单一碳源实验显示,基因簇2上7-HT合成突变株在苯乙酸或其类似物为单一碳源的培养基中具有不同程度的生长缺陷,基因簇2参与苯乙酸代谢途径,并参与7-HT的合成。苯乙酸降解参与环庚三烯类化合物的合成,双功能酶PaaZ催化苯乙酸降解和环庚三烯类化合物合成的分支途径。基因簇2上ORF13比对为PaaZ,在HYS菌株中过表达ORF13,抑制7-HT的产生;ORF13乙醛脱氢酶结构域点突变失活后,7-HT合成缺陷株△gacA中7-HT的产量得到回复,证实ORF13具有双功能,且参与7-HT的合成。ORF13受胞外铁浓度和Gac/Rsm系统调控。生物信息学分析可知,基因簇1包含10个合成酶(orf2-orf11)和2个调控蛋白(orf1和orf12)。共转录分析得出基面簇1 由 orf1、orf2-5、orf6-9、orf10-11 及 orf12 五个转录单元组成。orf1、orf6-9及orf12在前期工作中证实与7-HT合成有关;orf2-5的敲除株7-HT的产量部分下降或者不变,暗示该转录单元间接影响7-HT的合成;orf10-11的敲除株不产7-HT,正调节7-HT的产生。通过生物信息学分析,我们发现基因簇1仅存在于包括HYS菌株在内的六株假单胞菌中,具有一定的特殊性。3.基因簇1上两个不同调控家族蛋白LysR和TetR/AcrR共同参与7-HT合成的精细调控。比对分析确定ORF1为LysR型调控蛋白,ORF12为TetR/AcrR家族调控蛋白。我们证实铁浓度和Gac/Rsm系统对ORF1和ORF12的表达具有不同程度的调控作用,ORF1和ORF12正调节orff6-9的表达进而调控7-HT的合成。这两个蛋白位于同一调控通路调控7-HT产生,因此接下来我们探究了这两个蛋白在7-HT合成中的相互关系。有趣的是,在7-HT的产生中,ORF1位于ORF12的上游,这不同于文献中报导的LysR和TetR在细菌代谢中主要以平行关系发挥作用。两个不同调控家族蛋白相继作用调控7-HT的产生,这可能是一种新的调控模式,用于7-HT这类具有重要生物活性物质的精确调控。同时过表达ORF12抑制orf9的转录,进而导致7-HT产量的下降。TetR家族调控蛋白大多为抑制蛋白,通过形成多聚体,结合到靶基因启动子区的操纵子上,抑制目的基因转录。推测过表达的ORF12通过形成多聚体抑制orf9转录,进而抑制7-HT的合成。综上所述,本研究确定了新型铁载体7-HT的遗传基础和相关基因功能;探讨了 7-HT合成的可能途径;揭示了一个复杂的新的调控模式,包含Gac/Rsm系统以及两个不同调控家族蛋白ORF1和ORF12共同调控7-HT的生物合成,为铁载体及环庚三烯类化合物的生物合成及调控提供了更多的参考和借鉴;阐释了7-HT合成精细调控的生物学意义,增强了对假单胞菌在复杂多变的生态环境下的强适应性和强竞争力的认识。