前言:乳腺癌是女性一种常见的恶性肿瘤,已成为女性肿瘤患者死亡的主要原因。乳腺癌的发生经历了以下几个阶段:正常导管上皮→普通型导管上皮增生→不典型导管上皮增生→导管原位癌→浸润性导管癌,探讨与乳腺癌动态发展过程相关基因的改变对治疗乳腺癌具有重要意义。　　 SIAH2蛋白具有E3泛素连接酶的活性,可调节一些蛋白的泛素化和降解,这些蛋白包括DCC,Bag-1,TRAF2,PHD1/3,Spry2等。近来发现SIAH2可作为一种重要的肿瘤因子发挥生物学作用,SIAH2在有增殖能力的细胞中表达(正常和瘤细胞),如宫颈癌细胞,乳腺癌细胞,人胚肾细胞及结直肠腺瘤组织等,而在不增殖的细胞中表达缺失。研究报导抑制SIAH2的功能后能够阻断ERK信号通路,抑制软琼脂中胰腺癌细胞的自主生长和裸鼠体内胰腺肿瘤的形成,最近研究发现SIAH2在几乎所有类型肺癌组织中均有表达,并且随着肺癌分化程度的降低SIAH2的表达显著增加,而在正常肺组织中几乎不表达。Bcl-2是程序性细胞死亡的关键调节因子,它既能够与自身形成同源二聚体,也可以与Bcl-2家族其他蛋白形成异源二聚体。众所周知Bcl-2能够有效抑制Bax的凋亡作用,Bcl-2通过与Bak相互作用抑制Bax的构象改变,并且能够阻止Bax从胞浆到线粒体膜的易位,从而抑制细胞凋亡。　　 最近有研究发现抑制SIAH2的功能可以使其底物蛋白Spry2水平上调从而抑制ERK的磷酸化,进而调节细胞增殖和凋亡。而PD98059抑制ERK的活性后能够下调Bcl-2的表达。所以我们推测SIAH2可能通过ERK通路来调控Bcl-2,本研究目的旨在探讨乳腺组织及细胞系中SIAH2和Bcl-2的表达情况及与临床病理学参数的意义,探讨在乳腺癌细胞中干扰SIAH2的功能后Bcl-2表达的变化。　　 材料与方法:　　 1、材料　　 180例乳腺组织标本(包括33例正常乳腺组织,28例乳腺不典型增生组织,39例乳腺导管原位癌组织和80例乳腺浸涧性导管癌组织),均取自中国医科大学第一临床学院2007-2009年肿瘤外科手术切除的标本,所有患者术前均未接受放、化疗。标本经4％中性甲醛固定,石蜡包埋,HE常规染色后明确诊断。其中部分癌组织和正常乳腺组织离体后立即放入液氮后-70℃冰箱保存备用。2株乳腺癌癌细胞系(MDA-MB-435S和MCF7),1株人乳腺正常上皮细胞系(MCF-10A)。用含10％新鲜胎牛血清的DMEM培养基,在37℃,5％CO2的条件下培养。　　 2、主要试剂和来源SIAH2鼠单克隆抗体,SIAH2 siRNA,Bcl-2鼠单克隆抗体均购自美国SantaCruz公司。SP免疫组化试剂盒和DAB酶底物显色试剂盒购自福州迈新生物技术开发公司。　　 3、方法　　 (1)免疫组织化学染色及结果判定标本固定,石蜡包埋,制成4μm连续切片,采用链菌素抗生物素蛋白-过氧化物酶免疫组化法(S-P法)检测SIAH2和Bcl-2蛋白表达。以PBS缓冲液代替一抗为阴性对照。结果判定:SIAH2以细胞核中出现棕黄色颗粒为阳性显色,Bcl-2以细胞质中出现棕黄色颗粒为阳性显色。高倍视野(×400)下选阳性信号最强区域计数200个肿瘤细胞中阳性细胞数,根据免疫组化染色强度分为三个等级:浅黄色计为1分,棕黄色计为2分,黄褐色计为3分。按SIAH2和Bcl-2表达百分率分为以下四个等级:0％为0分,1％-50％为1分,51％-75％为2分,＞75％为3分。以染色强度和阳性细胞率的分值乘积作为每一例的积分,积分＜4者判定为阴性,积分≥4为阳性。　　 (2)Western Blot在收集的细胞内加入裂解液充分裂解,低温高速离心(4℃,15000转/min,30min),提取上清为总蛋白。上样蛋白量为60μg。电泳(12％SDS-PAGE凝胶)、转印至PVDF膜、封闭,一抗SIAH2(1:200)、Bcl-2(1:200)和β-actin(1:200),4℃孵育过夜,分别与各自对应的二抗(1:4000)室温孵育2小时,ECL显色,结果经自动凝胶成像分析仪采集,进行灰度值测定,β-actin做内参。　　 (3)siRNA干扰实验分三组:空白对照组、非特异性siRNA转染组和特异性siRNA转染组,每个实验均重复三次,转染具体步骤按Lipofect2000试剂说明书进行。　　 4、统计分析　　 各组资料应用SPSS13.0软件进行统计分析,P＜0.05为差异有统计学意义。　　 结果:　　 1、免疫组织化学结果SIAH2蛋白主要在细胞核表达,Bcl-2蛋白主要在细胞浆表达。在乳腺癌癌变过程(正常乳腺组织,不典型导管增生,导管原位癌,浸润性导管癌)中SIAH2和Bcl-2蛋白的阳性表达率呈逐渐升高趋势。两者表达水平均与乳腺癌组织学分级明显相关。在80利乳腺癌中SIAH2与Bcl-2蛋白表达呈正相关。　　 2、Westem Blot结果SIAH2蛋白和Bcl-2蛋白在乳腺癌组织及细胞系中的表达明显高于正常乳腺组织及细胞系,用SIAH2siRNA干扰乳腺癌细胞系MCF7和MDA-MB435S中SIAH2的功能后Bcl-2的蛋白水平较对照组下降。　　 结论:SIAH2与Bcl-2在乳腺癌发生发展中异常表达,两者之间存在相关性。