论文部分内容阅读
研究背景中枢神经系统损伤是指由于各种原因造成的脑和脊髓的损伤以及神经功能障碍,而神经元损伤及功能障碍被认为是最为重要的机制之一。以往研究发现,神经元损伤的相关机制主要包括谷氨酸兴奋性毒性、钙离子超载、氧化应激和炎症反应等,其中研究最为深入的是由谷氨酸、谷氨酸受体及钙离子代谢介导的兴奋性神经损伤相关机制。但是仍有很多问题没有解决,如m Glu R5在神经元损伤中的作用,以及综合调控外钙内流和内钙释放对神经元损伤的影响等。Homer1蛋白是一类新型的突触后致密物质,在神经元功能调控中发挥重要作用。我们以往的研究表明,在创伤性神经元损伤后,Homer1a表达明显增高,可能通过影响I组m Glu Rs在突触后膜上的锚定影响神经元损伤。然而,Homer1b/c和Homer1a在神经元损伤中究竟发挥什么样的作用,其具体分子机制如何尚不清楚。实验目的本研究的目的是:(1)以钙离子代谢和氧化应激反应为切入点,初步探讨谷氨酸所致神经元损伤的机制,研究m Glu R5在神经元损伤中的作用;(2)研究钙库调节钙离子通道在神经元损伤中的作用,探讨其阻滞剂神经保护作用的可能机制;(3)研究Homer1b/c在神经元损伤中的作用,明确其与内质网应激和线粒体功能障碍的关系;(4)研究Homer1a在神经元损伤中的作用,明确其与神经元外钙内流和内钙释放调控的关系。实验方法(1)细胞培养:原代小鼠皮层神经元离体培养;(2)离体神经元损伤模型:谷氨酸损伤模型;(3)在体神经元损伤模型:小鼠重物下落闭合性脑损伤模型;(4)离体神经元损伤评价:细胞活力检测、LDH释放检测、Caspase-3活性检测和神经元凋亡染色;(5)在体神经元损伤评价:脑组织含水量检测、脑组织缺损检测、神经功能学评分和神经元凋亡TUNEL染色;(6)基因表达调控:采用慢病毒介导的基因沉默与基因过表达技术上调/下调Homer1b/c和Homer1a的表达;(7)分子表达:分别采用荧光实时定量PCR、Western blot、免疫荧光、免疫组织化学方法检测各种分子的表达。实验结果:(1)谷氨酸引起的兴奋性神经元损伤是一种钙离子依赖性的氧化应激性损伤;m Glu R5激活对谷氨酸引起的兴奋性神经元损伤具有保护作用;m Glu R5通过PKC-ERK信号通路发挥神经保护作用;m Glu R5在TBI模型中发挥有限的神经保护作用;(2)SKF-96365减轻谷氨酸所致兴奋性神经元损伤;SKF-96365通过Homer1-Ca2+信号通路发挥神经保护作用;(3)下调Homer1b/c减轻谷氨酸所致兴奋性神经元损伤;下调Homer1b/c抑制谷氨酸所致的内质网钙离子释放;下调Homer1b/c减轻谷氨酸所致内质网应激;下调Homer1b/c保护谷氨酸损伤后的线粒体功能;(4)过表达Homer1a减轻谷氨酸所致兴奋性神经元损伤;过表达Homer1a综合调控外钙内流与内钙释放。实验结论:(1)谷氨酸所致神经元损伤是一种钙离子依赖性的氧化应激性损伤,激活m Glu R5有减轻神经元损伤作用。(2)钙库调节钙通道的非特异性离子通道阻滞剂SKF-96365可通过抑制神经元细胞内钙离子超载,减轻谷氨酸所致神经元损伤,其神经保护作用的发挥并不依赖于TRPC离子通道表达的变化,而与对Homer1功能抑制有关。(3)下调Homer1b/c的表达可以减轻神经元损伤,抑制神经元凋亡,这种神经保护作用与抑制内质网应激和保护线粒体功能有关。(4)过表达Homer1a可通过抑制ROS相关的氧化应激损伤减轻神经元凋亡,这种神经保护作用与综合调控神经元外钙内流和内质网内钙释放,减轻细胞内钙离子超载有关。