研究背景：甲基苯丙胺(Methamphetamine, METH),又称去氧麻黄碱,具有苯环结构,与儿茶酚胺类递质结构极其相似,易溶于水及酒精,其盐酸盐为透明的结晶体,状如冰,俗称“冰毒”。METH作为一种新型毒品,由于其合成技术简单、容易获得等原因,已成为世界上流行最快、滥用最为广泛的中枢兴奋剂之一。同时METH的长期滥用可引起各类刑事犯罪,给社会的治安带来极大危害。因此,对METH的毒性及其防治的研究已成为世界面临的重大课题和研究热点。本教研室关于METH神经毒性的前期研究中已经发现,METH作用后a-突触突触核蛋白(a-synuclein, a-SN)在纹状体等相关脑区表达升高,证实α-SN在METH所致的氧化应激、多巴胺(DA)代谢障碍和线粒体功能丧失等几种神经毒性机制中都扮演了重要角色,并且是一个关键的毒性靶点。大量证据表明,a-SN的异常表达与帕金森病(Parkinson, PD)、阿尔茨海默病(Alzheimer, AD)等神经退行性疾病的发病密切相关。影像医学研究资料和流行病学资料表明,METH使用者患PD的比率明显升高,METH可造成大脑额叶皮层、海马以及纹状体等脑区神经元的损伤,产生与AD以及PD相似的病理学改变。且已有文献报道a-SN基因是PD的致病基因,在一些家族型PD患者中存在α-SN的突变,且不论是家族性还是散在性PD中,a-SN都是PD特征性包涵体Lewy小体的主要组成成分。尤其α-SN的错义突变(A30P、A53T和E46K)和其核心序列(66VGGAVVTGV74)对PD起着至关重要的作用。α-SN在生理状态下为可溶性天然非折叠状态,在调节突触可塑性和递质释放等方面有重要的作用。在病理状态下呈聚集状态,在一些神经退行性疾病中,α-SN的聚集物不仅能够抑制DA合成限速酶酪氨酸羟化酶表达,还能促进细胞的氧化应激增强,对神经元产生毒性作用,同时氧化应激又是促进α-SN聚集的重要因素,从而造成恶性循环,加剧神经退行性疾病的进展。因此深入研究METH诱导的α-SN聚集机制具有重要意义,将为METH导致的神经毒性或其他的一些神经退行性疾病提供重要靶点。二硫键异构酶(Protein disulfide isomerase, PDI)是一种内质网滞留蛋白,参与新合成的分泌性蛋白质的修饰和折叠,催化硫醇-二硫键交换反应,形成二硫键,而二硫键在稳定蛋白质的三维结构中起着非常重要的作用。PDI有多个结构域,不仅能够催化巯基-二硫键交换反应,促进蛋白二硫键的生成和错配二硫键的重排,还具有氧化、还原和异构多种功能。此外,PDI同时还具有分子伴侣活性,能抑制错误折叠蛋白的聚集,稳定蛋白质的正确结构。在多种神经变性疾病中,如帕金森症、阿尔兹海默症等,PDI可通过抑制错误折叠蛋白的聚集以及遍在蛋白化,起到神经保护作用。然而在一些退行性疾病中,PDI易与氧化应激产生的NO结合,而形成S亚硝基化PDI (PDI-SNO)。 PDI-SNO可导致PDI的构象发生改变,其原有的氧化、还原、异构以及分子伴侣等功能受损。早在2006年,Uehara等在nature已报道研究发现PDI及PDI-SNO在蛋白质异常聚集相关神经系统变性疾病中具有重要地位,在散发的PD和AD患者脑组织样本中,PDI明显被S-亚硝基化。我们在前期试验中已发现,METH处理后,体内外的氧化应激都明显增强,NO生成明显升高。然而,METH诱导的氧化应激对PDI的作用,以及PDI对异常表达的α-SN的作用机制研究还未见有报道,尚需要研究证实。本研究拟建立METH中毒细胞模型,通过形态学、NOS含量、NO含量、凋亡、α-SN聚集及PDI的S亚硝基化等指标的检测,进一步验证METH引起中枢神经毒性作用。再通过NOS抑制剂(L-NNA)和NO供体(L-Arginine)验证氧化应激过程中PDI的变化,以及变化的PDI对异常表达的α-SN的影响,从而进一步完善METH诱导的a-SN异常表达的毒性机制,为治疗METH引起的毒性损伤提供理论基础。目的：建立METH中毒细胞模型,并给予NOS抑制剂和NO供体,通过形态学、NOS含量、NO含量、凋亡、a-SN聚集及PDI的S亚硝基化等指标的检测,从而研究METH诱导的氧化应激对PDI正常功能的影响,以及PDI在a-SN异常表达中所起的作用。再通过siRNA干扰技术反证之前所得的结果,以进一步明确METH、PDI以及a-SN这三者之间的联系,为METH神经毒性机制研究提供新的研究靶点。方法：1.METH中毒细胞模型的建立(1)10%新生胎牛血清(FBS)的DMEM培养基分别接种PC12细胞至96孔板中,在37℃和5%C02条件下培养,待细胞长至70%汇合时,分别用含Ommol/L、0.5mmol/L、1mmol/L、2mmol/L、3mmol/LMETH的2%血清培养基培养24小时,CCK-8法检测细胞存活率变化。(2)接种PC12细胞至10个6cm小皿中,待细胞长至70%汇合时,随机分成两组,其中一组的5个小皿用0.1mmol/L　L-NNA预处理30分钟,处理之后,两组的5个小皿的细胞分别用含Ommol/L、0.5mmol/L、1mmol/L、2mmol/L、 3mmol/LMETH的2%血清培养基培养24小时,生物素转化法和western Blot分别检测各组细胞PDI-SNO表达变化,并综合比较以选取适宜浓度的METH以建立中毒细胞模型。2.探究PDI对METH诱导的a-SN异常表达的作用机制接种PC12细胞至6孔板或96孔板或10cm培养皿中并将细胞分为6组：空白对照组(CON)、空白NOS抑制剂组(CON+L-NNA)、空白NO供体组(CON+L-Arginine)、给药组(METH)、给药NOS抑制剂组(METH+L-NNA)、给药NO供体组(METH+L-Arginine),24小时后,收集细胞或细胞液进行以下各项实验：(1)倒置显微镜下观察各组细胞形态学损伤变化、CCK-8法观察各组细胞存活率的表达变化。(2)TUNEL法和hoechst法检测各组细胞凋亡情况。(3)酶化学法检测NOS、NO的活性变化,Western B lot法检测NOS表达情况。(4)生物素转化法和Western Blot法检测各组细胞PDI-SNO表达变化。(5)Western Blot法和免疫荧光法检测a-SN表达变化,并采用共聚焦显微镜观察细胞内a-SN形态变化。3.PDI基因沉默的PC12细胞在METH和L-NNA共同处理下细胞内a-SN的表达情况(1)针对PDI基因设计并合成三条siRNA干扰序列,采用RNA干扰技术(RNAi)处理PC12细胞,采用Western Blot法检测出最有效的干扰序列。(2)采用最有效的干扰序列沉默PC12细胞的PDI表达后,用METH和L-NNA共同处理,采用Western Blot法和免疫荧光法检测α-SN表达变化。结果：1.METH中毒细胞模型的建立(1)以未经METH处理的PC12细胞为对照组,0.5-3mmol/L METH处理的PC12细胞存活率随METH浓度增加逐渐降低,除0.5mmol/L处理组与对照组相比无显著性差异(p>0.05)外,其他各浓度处理组与对照组相比均有显著性差异(p<0.05)。(2)相比于空白对照组,METH处理的PC12细胞PDI-SNO表达随METH浓度增加逐渐增高,在METH浓度大于2mmol/L时,PDI-SNO升高与对照组相比均有显著性差异(p<0.05)。当加入NOS抑制剂L-NNA时,可显著抑制METH引起的PDI-SNO表达升高,且当METH浓度为3 mmol/L时,抑制效果最为显著(p<0.01),故在后期试验中,选取3mmol/L浓度的METH建立中毒细胞模型。2.探究PDI对METH诱导的a-SN异常表达的作用机制(1)六组细胞模型分别经过不同的处理24h后,倒置显微镜下观察各组细胞形态变化,可见CON+L-NNA组细胞形态与CON组相比无明显变化,而CON+L-Arginine组和METH组细胞形态与CON组相比明显改变,可见胞体皱缩变圆,变圆细胞的胞质透亮度增加可见环形透亮区,且突起变短、断裂、甚至消失,并可见细胞脱壁漂浮,METH+L-NNA组与METH组相比,细胞形态改变有明显的改善,而METH+L-Arginine组与METH组相比,细胞形态改变更为显著。CCK-8法测得CON+L-NNA组细胞存活率较CON组无明显变化(P>0.05), CON+L-Arginine组和METH组细胞存活率较CON组显著下降(p<0.05),METH+L-NNA组细胞存活率较METH组显著升高(p<0.05), METH+L-Arginine组细胞存活率较METH组显著下降(p<0.05)。(2)采用TUNEL法和hoechst法检测6组细胞凋亡情况发现：CON+L-NNA组细胞凋亡较CON组无明显变化(P>0.05), CON+L-Arginine组和METH组细胞凋亡较CON组显著下降(p<0.05), METH+L-NNA组细胞凋亡较METH组显著升高(p<0.05), METH+L-Arginine组细胞凋亡较METH组显著下降(p<0.05)。(3)酶化学法检测发现：CON+L-NNA组细胞内NOS和NO活性较CON组无明显变化(P>0.05),CON+L-Arginine组和METH组细胞内NOS和NO活性较CON组显著升高(p<0.05),METH+L-NNA组细胞内NOS和NO活性较METH组显著降低(p<0.05),METH+L-Arginine组细胞内NOS和NO活性较METH组显著升高(p<0.05)。且通过Western Blot法检测细胞内NOS表达,结果与酶化学法检测结果一致。(4)生物素转化法和Western B lot法检测各组细胞PDI-SNO表达发现：METH和L-Arginine可使PDI发生显著的S亚硝基化,使得PDI-SNO表达显著升高(p<0.05),而L-NNA可有效抑制METH引起的PDI的S亚硝基化,L-Arginine则显著加剧METH引起的PDI的S亚硝基化。(5)Western B lot法检测各组细胞a-SN表达发现：CON+L-Arginine组和METH组细胞内a-SN相比于CON组显著升高(p<0.05),而METH+L-NNA组细胞内α-SN相比于METH组显著降低(p<0.05),METH+L-Arginine组细胞内a-SN相比于METH组显著升高(p<0.05)。在共聚焦显微镜下观察可见：CON+L-Arginine组和METH组细胞内a-SN发生显著聚集,L-NNA可有效抑制METH引起的a-SN的聚集,L-Arginine则显著加剧METH引起的a-SN的聚集。3.PDI基因沉默的PC12细胞在METH和L-NNA共同处理下细胞内a-SN的表达情况(1)针对PDI基因设计并合成三条siRNA干扰序列,采用RNA干扰技术(RNAi)处理PC12细胞,采用Western Blot法检测出最有效的干扰序列。结果显示三条siRNA序列都能够沉默PDI基因的表达,其中第二条序列沉默效果最好。(2)采用最有效的干扰序列沉默PC12细胞的PDI基因表达后,再用METH和L-NNA共同处理细胞24h,Western Blot法检测发现PDI沉默后的PC12细胞在METH和L-NNA共同处理下,L-NNA无法有效的抑制METH引起的a-SN的异常表达,且在共聚焦显微镜下观察的结果也与前者一致,a-SN的聚集无法得到显著抑制。结论：1. PDI-SNO在METH处理的PC12细胞株中表达显著上调,且上调趋势随METH浓度的增高而升高。NOS抑制剂L-NNA可有效抑制PDI-SNO的表达,且当METH的浓度为3mmol/L时,抑制效果最为显著。2.METH可诱导细胞产生氧化应激及细胞内a-SN发生聚集,氧化应激使得PDI发生S亚硝基化而无法抑制α-SN的聚集,聚集的a-SN使得细胞毒性增强,促进细胞凋亡。NOS抑制剂L-NNA可有效抑制这一过程从而抑制METH的神经毒性,而NO供体L-Areinine则作用相反。说明氧化应激使得PDI功能异常,进而无法通过抑制a-SN的聚集起到神经保护作用。3.PDI基因沉默的PC12细胞即使加入NOS抑制剂L-NNA,也无法抑制METH导致a-SN的聚集。说明PDI是抑制a-SN聚集的关键分子。