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低温严重影响植物的生长发育以及农作物的产量,并限制植物的地理分布。植物在长期进化过程中则产生了一套应对低温胁迫的机制叫做冷驯化,它是指植物在经历一段时间的低温条件(0°C以上)之后,对冷胁迫的耐受能力显著增强的一种机制。DREB1/CBF类转录因子则是调控植物冷驯化相关基因表达的重要转录因子之一。豆科植物是继谷类植物的第二大经济作物,其中苜蓿作为“牧草之王”具有重要的经济价值。因此研究豆科植物抵御冷胁迫的分子机制具有重要意义。前期的研究表明,截形苜蓿(Medicago trunctula)中CBF转录因子受低温诱导表达,但CBF在冷驯化信号途径中的功能以及如何响应低温的分子机制尚不清楚。本实验室通过基因芯片技术筛选获得了一个响应非生物逆境胁迫上调表达的DREB1/CBF类转录因子MtCBF4,其过表达材料对盐胁迫具有较为明显的耐受性。本论文进一步探索了MtBF4响应低温的分子机制。研究发现,MtCBF4的过表达材料在冷驯化和非冷驯化条件下均可以显著提高转基因植株对冷胁迫的耐受能力,而cbf4突变体则表现为冷敏感表型。转录组测序的结果表明,过表达MtCBF4可以提高抗冷相关基因的表达。进一步qRT-PCR、EMSA和ChIP-qPCR实验结果表明,MtCBF4能够结合在MtCAS15基因的启动子上,激活MtCAS15基因的表达。这些结果表明MtCBF4是通过直接激活MtCAS15的表达,增强截形苜蓿对冷胁迫的耐受能力。为了研究调控MtCBF4的上游基因,本实验室前期通过酵母单杂交实验筛选获得了一个MYB家族转录因子MtMYB3, MtMYB3能够结合在MtCBF4启动子上,并下调MtCBF4表达水平。本文对过表达MtMYB3转基因植株进行了抗冻表型的检测,结果表明过表达MtMYB3转基因植株对冷胁迫的耐受能力明显减弱,而myb3突变体对冷胁迫的耐受能力显著增强,并且myb3突变体中MtCBF4和MtCAS15基因的表达水平显著上调。说明MtMYB3在抗冷信号途径中是一个负调节子。而为了研究MtCBF4是如何被低温诱导表达的,本实验室前期还通过酵母双杂交文库筛选获得了能够与MtMYB3互作的另一个MYB类转录因子MtMYB61,本文进一步通过GST pull-down实验验证了MtMYB3蛋白与MtMYB61蛋白的互作,并检测了过表达MtMYB61的转基因植株的抗冻表型,结果表明过表达MtMYB61可以显著提高截形苜蓿对冷胁迫的耐受能力,而myb61突变体表现为冷敏感表型,而且在myb61突变体中,MtCBF4和MtCAS15基因的表达水平显著降低。酵母双杂交实验结果进一步证明MtMYB61能够与MtMYB3蛋白的DNA结合域互作,而EMSA和ChIP的实验结果证明MtMYB61能够影响MtMYB3结合在MtCBF4的启动子上。qRT-PCR结果表明,MtMYB3不受低温诱导表达,MtMYB61在低温处理1 h被诱导表达并达到最高水平,MtCBF4在低温处理2.5 h的时候被诱导表达,MtCAS15在低温处理12 h开始被诱导表达。说明MYB61是MtCBF4基因的表达以及截形苜蓿对冷胁迫的耐受能力的一个正调节子。综合上述结果,我们研究发现了截形苜蓿MtCBF4参与冷驯化以及响应低温的分子机制:在正常情况下,MtMYB3抑制MtCBF4基因的表达;当植物感受低温之后,MtMYB61基因上调表达,MtMYB61蛋白与MtMYB3蛋白互作并影响MtMYB3对MtCBF4的抑制作用,MtCBF4直接激活MtCAS15并上调其他冷胁迫相关基因的表达,进而提高植物对冷胁迫的耐受能力。本研究解析了MtCBF4参与豆科模式植物截形苜蓿冷驯化中的功能以及响应低温的分子机制,阐明了一条由两个MYB类转录因子通过互作精细调控MtCBF4基因表达的信号通路,并为豆科植物的抗冷育种奠定了理论基础。