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目的:甲状腺功能减退症(Hypothyroidism,简称甲减)是临床常见的一种内分泌系统疾病,由多种原因引起的甲状腺激素(thyroid hormones,TH)合成、分泌或生物效应不足导致的临床综合征。甲减的病因复杂,常以原发性甲减多见。成年期甲减除低代谢症候群、黏液性水肿等症状外,还伴有神经精神症状、肌肉与关节病变等。临床上甲减需使用甲状腺激素替代治疗(thyroid hormone replacement therapy),但部分患者替代至甲状腺激素水平正常时,其神经精神症状仍未完全缓解,其原因未明。本项目拟借助转基因小鼠建立甲减动物模型,研究甲减小鼠的认知行为变化,并以四碘甲腺原氨酸(levothyroxine,LT4)替代治疗,化学遗传学方法或药理学方法特异性调节胆碱能神经元活性,阐明基底前脑胆碱能神经元对甲减相关的认知功能的改善作用及调节机制。方法:雄性无特定病原体(Specific Pathogen Free,SPF)级ChAT-Cre小鼠(该转基因小鼠在胆碱乙酰移位酶,choline acetyltransferase,ChAT基因下游插入Cre重组酶基因,Cre重组酶基因受到ChAT基因启动子的调控,所以Cre重组酶特异性地表达于胆碱能神经元。)实验开始时体重约22-25 g,年龄8-10周。立体定位微注射法将AVV-DIO-hM3Dq-mCherry微量(20 nl/侧)注射至ChAT-Cre小鼠的基底前脑。术后将小鼠饲养在温度22oC±1oC,湿度55%-65%,明暗周期(12 h/12 h,开灯时间7:00)的实验室环境下,小鼠自由摄食、饮水。甲减模型小鼠以丙基硫氧嘧啶(Propylthiouracil,PTU)浓度为1 mg/ml溶于饮用水内,每周更换一次PTU溶液,同时更换动物垫料、称量体重,从第4周开始,LT4替代治疗小鼠在饮用PTU溶液的基础上,再给予LT4 10 mg/kg;共持续6-7周后开始进行电生理学及行为学等实验。脑片膜片钳技术检测正常小鼠及甲减小鼠基底前脑胆碱能神经元电生理学特性;化学遗传学方法结合被动回避实验或新物体识别实验研究基底前脑胆碱能神经元特异性激活后甲减小鼠学习记忆能力变化,所有实验结束后,通过心脏取血,测量血清T3、T4及TSH水平评价不同小鼠的甲状腺功能。C57BL/6j小鼠分为5组,分别为对照组、甲减组、LT4治疗组、LT4+多奈哌齐(5 mg/kg)治疗组和LT4+多奈哌齐(10 mg/kg)治疗组。甲减模型小鼠PTU(1mg/ml)饮水,每周更换一次PTU溶液,同时更换动物垫料、称量体重,从第4周开始,LT4替代治疗小鼠在饮用PTU溶液的基础上,再给予LT4 10 mg/kg;LT4联合多奈哌齐治疗的小鼠则是在PTU基础上,给予LT4 10 mg/kg和多奈哌齐5、10 mg/kg。药理学方法特异性调节小鼠脑内胆碱能神经元活性,同时借助被动回避试验和新物体识别试验测定不同小鼠的学习记忆能力,行为学实验结束,动物麻醉后,通过心脏取血,测量血清T3、LT4及TSH水平评价不同小鼠的甲状腺功能。并探讨基底前脑胆碱能神经元对甲减相关脑认知能力的影响及机制。结果:对于ChAT-Cre小鼠,与正常对照组相比,甲减小鼠在第1、2周体重明显低于正常对照组小鼠,第3、4、5、6周各组小鼠的体重无显著性差异。甲状腺激素水平测定发现甲减小鼠的血清T3、T4水平均低于对照组小鼠和LT4替代治疗小鼠,而甲减小鼠的血清TSH水平显著升高。甲减小鼠胆碱能神经元动作电位幅度降低、静息膜电位水平升高等,LT4替代治疗后未完全恢复。脑立体定位微注射法将化学遗传学载体蛋白hM3Dq特异性表达在胆碱能神经元,免疫荧光染色确认hM3Dq表达在胆碱能神经元。氧化氯氮平(clozapine O oxide,CNO)可特异性激活神经元上的hM3Dq从而启动Gq信号通路,兴奋基底前脑胆碱能神经元。全细胞脑片膜片钳记录发现CNO可诱导胆碱能神经元放电持续增加,兴奋神经元。被动回避试验发现相对于正常对照组小鼠,甲减小鼠潜伏期显著缩短,而LT4替代治疗不能使其完全恢复到正常对照组水平,给予CNO后特异性激活基底前脑胆碱能神经元可显著增加甲减和LT4治疗后小鼠的潜伏期,提高其学习记忆能力。对C56BL/6j小鼠,与正常对照组相比,甲减小鼠在第1、2周体重明显低于正常对照组小鼠,第3、4、5、6周各组小鼠的体重无显著性差异。甲状腺激素水平测定发现甲减小鼠血清T3、T4水平均低于对照组小鼠、LT4替代治疗或LT4联合多奈哌齐治疗小鼠,而甲减小鼠的血清TSH水平显著升高。LT4联合不同剂量的多奈哌齐(5、10 mg/kg)治疗后,多奈哌齐可呈剂量依赖的缩短小鼠的潜伏期,增强小鼠的学习记忆能力。同样地,新物体识别试验结果也提示甲减或LT4替代治疗小鼠的新物体识别分数较低。研究表明,多奈哌齐是一种中枢神经系统内乙酰胆碱酯酶(AChE)抑制剂,对外周组织的AChE作用很小。多奈哌齐能抑制AChE活性,减慢突触间隙内乙酰胆碱(ACh)的分解,提高突触间隙内ACh含量,提高胆碱能神经活性,从而改善认知功能,可有效提高小鼠的学习记忆能力。结论:1.甲减小鼠基底前脑胆碱能神经元电生理特性受损、LT4替代治疗之后胆碱能神经元活性未恢复到正常对照组水平,提示甲减小鼠基底前脑胆碱能神经元活性受损,而LT4替代治疗不能完全恢复胆碱能神经元活动。2.化学遗传学方法可有效诱导基底前脑胆碱能神经元放电增加,特异性激活基底前脑胆碱能神经元,可显著提高甲减小鼠的学习记忆能力。3.LT4联合多奈哌齐治疗后,通过药理学手段提高脑内胆碱能神经系统活性,也可有效提高甲减小鼠的认知能力。