前言臭氧层破坏的加剧和太阳风暴的频繁出现导致到达地面的紫外线（ultraviolet，UV）日益增加，过多接触UV可引起皮肤红斑、光老化、免疫抑制乃至肿瘤等多种生物学效应。长波紫外线（UVA）在太阳光谱中所占比例大，且穿透力强，其对机体免疫抑制的研究倍受关注。表皮中皮肤角质形成细胞（keratinocytes，KC）含量最为丰富，占表皮细胞的90％以上，KC可通过释放细胞因子间接地影响机体免疫功能。目前尚不清楚UVA是如何诱导KC细胞因子的产生。本研究通过体外培养的人永生化角质形成细胞（HaCaT细胞株），探讨UVA照射对人KC细胞TNF-α、IL-1β、IL-10表达的影响，并分别以抗氧化剂（β-胡萝卜素）、JNK抑制剂（SP600125）干预处理，揭示氧化应激和JNK传导通路在UVA诱导人KC细胞TNF-α、IL-1β、IL-10表达中的作用。实验方法一、细胞培养HaCaT细胞以MEM培养基（内含1‰非必需氨基酸、10％胎牛血清、100U／ml青霉素、100mg／ml链霉素）于37℃、5％CO₂及饱和湿度条件下培养，待细胞呈单层、亚融合状态时，以0.25％胰蛋白酶消化，制成单个细胞悬液后传代培养。二、细胞活力将细胞接种于96孔培养板中，37℃、5％CO₂及饱和湿度条件下培养，待细胞生长至约60％融合，弃培养液，PBS冲洗3次，按100μl／孔加入PBS，以0～3.6 J／cm²不同剂量的UVA照射细胞，MTT法检测各组细胞活力。待细胞培养至约60％融合，向细胞培养液中加入终浓度为3μM的β-胡萝卜素（DMSO溶解），对照组和照射组加入等量DMSO。1h后弃培养液，PBS冲洗3次，按100μl／孔加入PBS，以0～3.6 J／cm²不同剂量的UVA照射干预组和照射组细胞，再按上述方法检测各组细胞活力。三、磷酸化JNK及非磷酸化JNK水平将细胞接种于预先置有盖玻片的6孔培养板中，培养2d，弃培养液，PBS冲洗3次，按1.0ml／孔加入PBS，以2.4 J／cm²UVA照射细胞，分别于照射后0、2、4、12、24、48h采样。对照组细胞不照射，其他处理同照射组。免疫荧光法检测细胞磷酸化JNK和非磷酸化JNK水平。按上述方法培养细胞。向干预组细胞的培养液中加入终浓度为3μM的β-胡萝卜素（DMSO溶解），对照组和照射组加入等量DMSO。1h后弃培养液，PBS冲洗3次，以1.0ml／孔加入PBS，照射组和干预组细胞以2.4 J／cm²UVA照射，再按上述方法采样并检测各组细胞磷酸化JNK和非磷酸化JNK水平。四、TNF-α、IL-1β、IL-10 mRNA水平及蛋白表达将细胞接种于9.0cm平皿中培养，待细胞呈亚融合状态，弃培养液，PBS冲洗3次，按5.0ml／皿加入PBS，根据细胞活力检测结果，选择2.4 J／cm²作为UVA辐射剂量，分别于照射后0、2、4、12、24、48h收集细胞及上清液。对照组不照射，其他处理同照射组。RT-PCR方法检测细胞TNF-α、IL-1β、IL-10 mRNA水平；ELISA方法检测上清液中TNF-α、IL-1β、IL-10含量。待细胞呈亚融合状态，向干预组细胞的培养液中加入终浓度为3μM的β-胡萝卜素或10μM的SP600125（DMSO溶解），对照组和照射组加入等量DMSO。1h后弃培养液，PBS冲洗3次，按5ml／皿加入PBS，照射组和干预组细胞经2.4／cm²UVA照射，再按上述方法采样并检测各组细胞TNF-α、IL-1β、IL-10 mRNA及蛋白水平。五、统计分析采用SPSS12.0统计软件对实验数据进行分析，检验水准α为0.05。实验结果一、细胞活力3.0、3.6 J／cm²UVA照射使细胞活力明显降低（P＜0.05）；2.4 J／cm²及其以下剂量的UVA照射对细胞活力无明显影响；β-胡萝卜素预处理细胞后，各组细胞活力差异无统计学意义（P＞0.05）。二、磷酸化JNK及非磷酸化JNK水平2.4 J／cm²UVA照射HaCaT细胞后0～24h，磷酸化JNK及非磷酸化JNK水平均逐渐升高，24h达高峰，48h有所降低，但仍高于0～12h各检测时点；对照组磷酸化JNK及非磷酸化JNK水平则随着采样时点延长而逐渐升高，48h达高峰。统计结果表明，照射组细胞磷酸化JNK水平在各采样时点及非磷酸化JNK水平于0～2h及12～48h均明显高于对照组（P＜0.05）。β-胡萝卜素干预组细胞磷酸化JNK水平于照射后0h基本同照射组，二者均明显高于对照组（P＜0.05）；2h后干预组细胞磷酸化JNK水平明显低于照射组（P＜0.05），24h后明显低于对照组（P＜0.05）；β-胡萝卜素干预组细胞非磷酸化JNK水平于0～48h均明显低于照射组（P＜0.05），4～48h明显低于对照组（P＜0.05）。三、TNF-α、IL-1β、IL-10 mRNA水平及蛋白表达（一） TNF-α、IL-1β、IL-10 mRNA水平0～48h对照组细胞TNF-α、IL-1βmRNA水平较平稳；照射组细胞TNF-α、IL-1βmRNA水平于照射后0h开始升高，2h达高峰，12h后恢复至对照组水平。统计结果表明，0～4h照射组细胞TNF-α、IL-1βmRNA水平明显高于对照组（P＜0.05）。β-胡萝卜素干预组细胞TNF-α、IL-1βmRNA水平于照射后0～48h基本同对照组，0～4h干预组及对照组细胞TNF-α、IL-1βmRNA水平均明显低于照射组（P＜0.05），12～48h各组细胞TNF-α、IL-1βmRNA水平差异无统计学意义（P＞0.05）。SP600125干预组细胞TNF-αmRNA水平于照射后0～48h均低于照射组，其中，0～4h及24～48h两组差异有统计学意义（P＜0.05），并于12～48h干预组细胞TNF-αmRNA水平明显低于对照组（P＜0.05）；SP600125干预组细胞IL-1βmRNA水平于照射后0～48h均明显低于照射组（P＜0.05），并于12～48h明显低于对照组（P＜0.05）。以2.4 J／cm²UVA照射细胞后12h，IL-10 mRNA呈弱表达，照射组其他各检测时点及对照组、β-胡萝卜素和SP600125干预组细胞均未见IL-10 mRNA表达。（二） TNF-α、IL-1β、IL-10蛋白表达0～48h对照组细胞TNF-α、IL-1β蛋白表达水平较平稳；照射组细胞TNF-α、IL-1β蛋白表达水平于照射后0～4h基本同对照组，12h高于对照组，24h后恢复至对照组水平。统计结果表明，照射组细胞TNF-α、IL-1β蛋白表达水平于照射后12h明显高于对照组（P＜0.05）。β-胡萝卜素干预组细胞TNF-α、IL-1β蛋白表达水平于照射后0～48h基本同对照组，干预组及对照组细胞TNF-α、IL-1β蛋白表达水平于12h明显低于照射组（P＜0.05）。SP600125干预组细胞TNF-α蛋白表达水平于0～48h均低于照射组和对照组，其中，12～48h明显低于照射组（P＜0.05），24～48h明显低于对照组（P＜0.05）。SP600125干预组细胞IL-1β蛋白表达水平于0～4h基本同对照组和照射组，12h明显高于对照组（P＜0.05），但明显低于照射组（P＜0.05），24～48h明显高于照射组和对照组（P＜0.05）。以2.4 J／cm²UVA照射细胞后24h，培养液中可检测到较低水平的IL-10蛋白，照射组其他各检测时点及对照组、β-胡萝卜素和SP600125干预组细胞均未检测到IL-10蛋白表达。结论3.0 J／cm²及其以上剂量的UVA照射使体外培养的HaCaT细胞活力明显降低，β-胡萝卜素对UVA诱导的HaCaT细胞活力下降具有拮抗作用。2.4 J／cm²UVA照射使HaCaT细胞JNK活性增强，β-胡萝卜素对UVA致HaCaT细胞JNK活性增强具有拮抗作用。2.4 J／cm²UVA照射使HaCaT细胞TNF-α及IL-1β基因转录增强、蛋白表达增多，正常情况下HaCaT不表达IL-10，UVA照射可诱导其表达。β-胡萝卜素、SP600125对UVA上调HaCaT细胞TNF-α、IL-1β表达以及对IL-10表达的诱导均具有拮抗作用。