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目的与背景肺癌严重威胁人类健康和生命,近年来其发病率和病死率明显增高,上升幅度居各种肿瘤之首。随着分子生物学研究的深入,越来越多的与细胞增殖、分化和凋亡密切相关的分子及信号通路被发现参与肺癌的发生发展。其中miRNA是近年来备受关注的一类分子,由高等真核生物基因组编码,通过对一系列靶分子mRNA的调控参与细胞增殖、分化、凋亡等过程。MiRNA的异常表达和调控参与多种肿瘤的发生发展。在肺癌的发病机制研究中,相关的miRNA报道已越来越多,但尚缺乏更加系统和深入的工作。全面分析miRNA的异常表达与肺癌发生发展的关系,深入进行功能研究,阐明其作用机制,将能够为肺癌的临床诊断和生物治疗提供新的策略和方法。通过检测人肺鳞状细胞癌组织中miRNA的表达变化,筛选在正常组织和人肺鳞状细胞癌组织中差异表达的miRNA分子,进一步验证其功能及分子机制,为深入认识miRNA在肺癌发生发展中的作用奠定基础,为药物靶点的筛选提供理论依据。材料与方法1.临床收集3例人肺鳞状细胞癌组织样本,以各自癌旁组织为对照,分别提取RNA,采用miRCURY? LNA微阵列进行杂交检测,其包括1200个探针,对应人的711个miRNA。对芯片结果变化差异在1.5倍以上且具有统计学意义的miRNA分子进一步采用实时定量PCR加以验证。将临床样本扩大为20例,采用实时定量PCR方法进一步检测上述芯片和PCR结果一致的miRNA分子的表达变化。2.对上述方法筛选出来的在肿瘤组织中稳定低表达的miRNA进行功能和机制的研究。在肿瘤细胞系中恢复其表达,检测肿瘤细胞生物学特性的改变,并进一步探讨其分子机制。结果1.在临床收集的3例人肺鳞状细胞癌组织样本中进行miRNA芯片检测,与癌旁组织对照,发现有65个miRNA出现明显变化;对芯片数据进行t检验,结果显示有8个miRNA(miR-143,miR-126, miR-193a-3p, miR-30d, miR-30a, miR-101, let-7i, and miR-15a)显著性下调(P<0.05),2个miRNA(miR-185*和miR-125a-5p)显著性上调(P<0.05);选取芯片结果中出现变化的miR-551b,miR-765和miR-126进行验证,实时定量PCR检测结果显示表达变化与芯片结果一致。扩大临床样本,在20例肺鳞状细胞癌组织样本中,对芯片结果变化大于1.5倍的miRNA进行实时定量PCR检测,发现let-7i在8例鳞癌样本中表达上调,12例样本中下调;miR-125-5p在10例中上调,10例中下调;miR-126在1例鳞癌样本中上调,19例中下调;miR-143在20例鳞癌样本中表达均下调。2.选取变化最为显著的miR-143为主要研究对象,在低表达miR-143的肺癌细胞系A549中将其过表达后,可抑制肿瘤细胞的增殖、克隆形成和转移能力;细胞周期分析发现可以引起细胞G0/G1至S期的阻滞,增殖调控分子K-RAS和CCND1表达降低;细胞凋亡增加,抗凋亡分子BCL-2降低,凋亡分子BAX、CASPASE-3表达增加。结论我们首次建立了中国人肺鳞状细胞癌miRNA基因表达谱,筛选到了一系列在肺鳞状细胞癌中异常表达的miRNA,这些miRNA可能参与了肺鳞状细胞癌的发生发展;其中miR-143的降低在其中发挥着重要作用,恢复miR-143的表达能够有效逆转肿瘤细胞的恶性增殖和转移能力。其深入的机制研究发现,一方面,miR-143能够降低K-RAS的表达,减弱RAS-ERK的促增殖信号;miR-143还能降低细胞周期分子CCND1的表达,引起细胞周期阻滞;另一方面,miR-143还能够减弱BCL-2的抗凋亡作用,促进CASPASE-3诱导的凋亡通路活化。通过以上抑制增殖和促进凋亡,miR-143在抑制肿瘤发生过程中发挥着重要的作用。