猪塞尼卡病毒A(SVA)HN16的分离鉴定及生物学特性研究

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猪塞尼卡病毒A(Senecavirus A,SVA)是最近几年才被确诊的的猪流行性病毒,它可以引起猪口鼻及蹄冠等区域出现水疱、溃疡和溃烂创面等症状。我国于2015年3月出现猪感染SVA疫情,2016年我国首株SVA被分离鉴定。随着SVA在我国广州、湖北、黑龙江等地的报道,该疫情范围正在逐渐扩大,因此对SVA新发现毒株进行分离鉴定以及研究其生物学特征等具有重要意义。本研究以华南某猪场送检样品中检测到的SVA为研究对象,主要内容如下:参考GenBank中已经公布的SVA基因序列设计一对特异性引物,从华南某猪场鼻、蹄冠处出现水疱样症状的仔猪内脏及水疱液等样品中检测到SVA阳性,经过测序确认为SVA,将其命名为SVA HN16。对检测到的SVA HN16毒株进行敏感细胞系研究。分别将病毒液接种至PK-15和BHK细胞系并传代,SVA在两种细胞中都出现病变,能够稳定传至30代,每隔3代对所收获的病毒液进行RT-PCR鉴定,结果证明SVA HN16毒株被成功分离,并且能够稳定增殖。分别对两种细胞中病毒滴度进行测定,结果显示,PK-15细胞传至F30TCID50=105.81/mL,而BHK细胞F30 TCID50=105.12/mL。HN16毒株在PK-15细胞上更为敏感。将SVA HN16毒株在PK-15细胞上传至50代后,TCID50检测结果为F5TCID50=105.59/mL,F30 TCID50=105.81/mL,F50 TCID50=106.12/mL,并且在病毒传代的过程中,细胞出现病变的时间逐渐缩短,病变的程度逐渐加剧,病毒传至第50代时毒价较之前有了明显提升。利用分段扩增法对SVA HN16毒株全基因组进行克隆和测序,并利用生物学软件对测序结果进行拼接、编码区分析、核苷酸同源性分析、遗传进化分析等,结果显示,SVA HN16毒株基因组大小为7280 bp,5’端为668 bp的非翻译区(Untranslated region,UTR),3’端为66 bp的Poly A尾。该基因组仅有一个大的开放读码框(Open Reading Frame,ORF),其中包含6546个碱基,可编码2181个氨基酸。核苷酸同源性分析结果显示,与SVA HN16同源性最高的是中国分离株CH-02-2015和CH-03-2015,均为99.1%;与SVA HN16同源性最低的是美国分离株ATCCPTA-5343,为93.7%。除此之外,与近几年其它中国、美国、泰国等分离株的同源性为95.5%98.9%。遗传进化分析结果显示,SVA HN16毒株与中国分离株CH-02-2015和CH-03-015的亲缘关系最近,其与近几年中国、美国、泰国等国家的分离株一起被归类到谱系Ⅲ,美国分离株ATCCPTA-5343和SVV-001被归类到谱系Ⅰ,美国分离株88-23626、92-48963、90-10324、89-47752则被归类为谱系Ⅱ。本次分离到的SVA HN16毒株为塞尼卡病毒A中国分离株,隶属于塞尼卡病毒属,而且该毒株与其他广东毒株亲缘关系最近。对SVA HN16毒株进行猪体回归感染实验。分别对攻毒后的猪血清、肛拭子和鼻拭子进行SVA病原检测,结果表明:该病毒在10 dpi血清检测病毒呈现弱阳性,而5 dpi和15 dpi并未检测到病毒存在;仔猪肛拭子在36 dpi时病毒检测为阳性,915 dpi检测为阴性;采集的鼻拭子中未能检测到病毒的排出;在10 dpi猪的血清中和抗体效价为1:22。利用SVA HN16毒株对新西兰大白兔进行感染实验,并对其抗体动态变化进行研究,结果显示:在6 dpi出现中和抗体(1:8),随着时间的推移,1218 dpi血清抗体中和效价逐渐升高,在25 dpi达到最大值(1:27),之后,抗体效价开始降低。本研究通过对华南地区新发现毒株SVA HN16的分离鉴定、序列分析、遗传进化分析、动物回归实验以及中和抗体动态变化等基础研究,为后续该病的致病机理研究及防控等提供一定的理论依据。
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