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1.背景和目的目前文献表明,肿瘤基因的功能异常在肿瘤发生及发展的一系列病理过程中扮演着不可或缺的角色。除了机体内部基因突变及外来刺激物激活癌基因之外,启动子区域CpG岛的甲基化异常导致的抑癌基因的沉默亦是肿瘤发生的重要机制。研究证实,DNA甲基转移酶催化的DNA甲基化作用类似于基因编码区的突变,正是这一修饰作用导致了抑癌基因的沉默。与基因突变有异的是,DNA的异常甲基化状态可被DNA甲基转移酶抑制剂所逆转,从而使沉默的抑癌基因重新表达。目前被FDA认证的DNA甲基转移酶抑制剂中,以5-氮杂胞苷(5’-azacytidine)和5-氮杂-2’-脱氧胞苷(5-Aza-2’-deoxycytidine)的应用最为广泛。其中,5-氮杂-2’-脱氧胞苷(5-Aza-2’-deoxycytidine)因其只与DNA相结合,对RNA及蛋白质合成的影响较5-氮杂胞苷(5’-azacytidine)小,同时它的脱甲基化作用至少是5-氮杂胞苷(5’-azacytidine)的十倍,因此已成为目前普遍使用的DNA甲基转移酶抑制剂。胃癌,一种高死亡率的肿瘤,日益威胁着全球人类的健康。国内外研究学者均已证实,启动子区域的高度甲基化所诱导的一系列抑癌基因的沉默是胃癌发生的重要分子学事件。如何在目前化疗药物疗效欠佳的前提下,研发一种卓有成效的抗胃癌制剂是国际肿瘤学研究领域关注的热点。5-氮杂-2’-脱氧胞苷(5-Aza-2’-deoxycytidine),一种核苷类似物,因其具有显著的脱甲基化、诱导肿瘤细胞凋亡等作用,因而在临床上被广泛应用于骨髓增生异常综合征(MDS)的治疗。在实体肿瘤中包括胃癌,5-氮杂-2’-脱氧胞苷(5-Aza-2’-deoxycytidine)是否具有类似的抗癌毒性,及其具体的分子作用机制是本课题研究的关键所在。一方面,本实验旨在观察甲基转移酶抑制剂5-氮杂-2’-脱氧胞苷(5-Aza-2’-deoxycytidine)是否对胃癌细胞具有生长抑制作用；另一方面,通过深入探讨5-氮杂-2’-脱氧胞苷(5-Aza-2’-deoxycytidine)与各种信号通路之间以及与基因甲基化之间的关系,为明确胃癌的致病机制及未来基因治疗方向提供一定的理论和现实依据。2.方法本实验选取野生型P53的胃癌AGS细胞分别用不同浓度和不同时间的5-氮杂-2’-脱氧胞苷处理,MTT检测细胞活力,流式细胞仪检测细胞周期的变化。为了进一步明确5-氮杂-2’-脱氧胞苷的处理能否诱导肿瘤细胞凋亡,本实验用一系列的检测手段,例如：Annexin Ⅴ, DNA ladder、Hoechst33258染色以及caspases活性测定。既往研究已证实,5-氮杂-2’-脱氧胞苷可掺入细胞的DNA从而诱导细胞发生DNA断裂损伤。为了验证这一理论在胃癌细胞中的真实性,本实验采用了彗星实验。Western blotting(?)(?)RT-PCR用来分析细胞在5-氮杂-2’-脱氧胞苷处理前后有关基因和蛋白的变化。此外,也用甲基特异性PCR (Methylation Specific PCR; MSP)去进一步检验5-氮杂-2’-脱氧胞苷对肿瘤AGS细胞甲基化状态的影响。3.结果与讨论从第一部分的实验结果可知,5-氮杂-2’-脱氧胞苷显著地抑制了胃癌AGS细胞的生长增殖。更为重要的是,其细胞毒性作用表现为浓度和时间依赖关系。流式分析细胞周期的结果显示,胃癌的AGS细胞在用不同时间的5-氮杂-2’-脱氧胞苷处理后,细胞阻滞在G2期。在有关凋亡的检测中,本次实验发现5-氮杂-2’-脱氧胞苷显著地诱导了胃癌AGS细胞发生凋亡。第二部分的实验就5-氮杂-2’-脱氧胞苷的抗胃癌作用机制进行了深入的探讨,得出了如下的结果：1)5-氮杂-2’-脱氧胞苷诱导的胃癌AGS细胞发生凋亡是由caspase9所介导的线粒体凋亡路径而发挥作用的。同时,在5-氮杂-2’-脱氧胞苷作用过程中,由于线粒体损伤导致了凋亡因子如：BAX和细胞色素C的释放。2)彗星实验的结果显示,5-氮杂-2’-脱氧胞苷使AGS细胞发生DNA断裂损伤,并且它表现出时间依赖效应。ATM(ataxia-telangiectasia mutated), DNA损伤的感应因子,在5-氮杂-2’-脱氧胞苷作用后即发生磷酸化,从而激活了相应的下游通路的效应因子如：P53、P21以及caspases活化。3)P53的状态可影响胃癌细胞对5-氮杂-2’-脱氧胞苷的敏感性,因为实验表明用P53的抑制剂可显著减弱5-氮杂-2’-脱氧胞苷对AGS的细胞毒性作用。4)5-氮杂-2’-脱氧胞苷通过抑制DNA甲基转移酶的活性而使沉默的甲基化抑癌基因P16重新恢复表达,使它在5-氮杂-2’-脱氧胞苷的抗肿瘤机制中发挥了一定的作用。4.结论5-氮杂-2’-脱氧胞苷通过促进肿瘤细胞发生凋亡,从而使其可作为一种有效的抗胃癌药。这一结论将为5-氮杂-2’-脱氧胞苷在临床上的应用提供强有力的依据。