论文部分内容阅读
本实验以鮰爱德华氏菌(Edwarsiella ictaluri)GPY株的基因组DNA为模板,克隆出三段外膜微孔蛋白N全基因(Outer membrane protein, OMP),并应用生物信息学相关软件对其氨基酸序列进行分析。去信号肽和跨膜区后克隆并表达了其对应的三段功能活性区域,并通过免疫印迹确定表达产物具有免疫原性,初步将其确定为亚单位候选疫苗。用表达的rOmpNs作为抗原,免疫健康斑点叉尾鮰,探究其对斑点叉尾钢的免疫保护效果。通过本实验,拟对鮰爱德华氏菌ompNs的生理特性进行初步探讨,并为制备具有保护力的抗鮰爱德华氏菌亚单位疫苗提供理论基础。本研究共分为三个章节,概述如下：1.鮰爱德华氏菌ompN全基因克隆、鉴定和序列特性分析对鮰爱德华氏菌ompNs全基因进行克隆,获得阳性克隆质粒pMD19-T-omp N1、pMD19-T-ompN2和pMD19-T-ompN3。利用生物信息学相关软件分别对opmN1、ompN2和ompN3编码的氨基酸序列进行分析。结果显示鮰爱德华氏菌GPY菌株的ompNs基因编码的氨基酸序列均含有一个外膜通道蛋白(OM_channel family)结构域,均含有1个信号肽和跨膜区,并且信号肽与跨膜区的位置相似。OmpN1、OmpN2和OmpN3均为疏水性蛋白。抗原表位预测结果显示OmpN1具有15个抗原表位,13个分布在蛋白表面的区域。OmpN2具有14个抗原表位,8个分布在蛋白表面区域；OmpN3具有15个抗原表位,12个分布在蛋白表面的区域。B细胞表位预测结果显示OmpN1、OmpN2和OmpN3分别有10、9、11个B细胞表位。选取不同致病菌的外膜蛋白氨基酸序列构建系统发育树,发现ompN1、ompN2和ompN3基因编码的氨基酸序列与其他革兰氏阴性细菌的外膜微孔蛋白N聚为一支。OmpN2与E. coli外膜蛋白的亲缘关系较近,OmpN1、OmpN2和OmpN3则分于两支。2.鮰爱德华氏菌ompNs功能活性区域原核表达、兔抗鮰爱德华氏菌多克隆抗体制备及特性分析根据生物信息学分析结果,选取去掉信号肽的N端前22个氨基酸的核酸序列设计特异性引物进行PCR扩增,获得的阳性克隆子经鉴定正确后连接至表达载体pET-32a(+),分别得到重组表达质粒pET-32a(+)-powpN1/pET-32a(+)-pompN2/pET-32a(+)-pompN3。鉴定成功后,将重组表达质粒转入BL21(DE3)和Rosetta(DE3)宿主菌,并进行诱导表达。用0.3%(V/V)福尔马林灭活鮰爱德华氏菌并免疫健康新西兰大白兔制备兔抗鮰爱德华氏菌多克隆抗体,通过Western-blotting检测兔抗鮰爱德华氏菌多克隆抗体与重组蛋白rOmpNs的免疫原性。结果显示：表达的重组rOmpN1约为61.8kDa,rOmpN2约为58.7kDa,rOmpN3约为59.1kDa,且均以包涵体的形式表达；凝集试验显示制备的兔抗鮰爱德华氏菌血清抗体效价为1：32;Western-blotting分析结果显示制备的血清能够分别与重组蛋白进行特异性结合。3.鮰爱德华氏菌rOmpNs对斑点叉尾鮰的免疫保护效果研究分别用单一的rOmpN1、rOmpN2、rOmpN3以及三者1：1：1的混合物,以2μg/g鱼体重免疫健康斑点叉尾鮰,以PBS为对照。测定免疫后第7d、14d、21d、28d、35d、42d、49d和56d分别收集斑点叉尾鮰的血清备用,检测各个时间点血清溶菌酶活力,补体旁路途经溶血活性(ACH50),总超氧化物歧化酶(T-SOD),碱性磷酸酶(AKP),酸性磷酸酶(ACP),血清总蛋白含量及产生的特异性抗体滴度,并于免疫后第29d用鮰爱德华氏菌GPY株进行攻毒。结果显示：rOmpNs免疫斑点叉尾鮰后第14d抗体水平开始增加,第28d至35d达到峰值,之后开始下降。且其中混合组第28d抗体水平最高(1：128),其次为rOmpN3(1:64),再次为rOmpNl和rOmpN2组(1：32)。攻毒试验显示：5个组rOmpN1、rOmpN2、 rOmpN3、混合组和PBS组14d的累积死亡率分别为30%、30%、25%、20%和80%,相对免疫保护率分别为62.5%、62.5%、68.75%和75%,且死亡鱼体内分离到的唯一致病菌为鮰爱德华氏菌。以上结果表明重组的3个rOmpNs蛋白均较好的免疫保护作用,且混合免疫效果最佳,能够作为针对鮰爱德华氏菌的候选疫苗之一。