在糖尿病大血管及微血管并发症中,内皮细胞功能异常发挥关键作用。导致内皮功能异常的机制是多方面的,能量代谢失衡、钙超载、氧自由基、炎症反应和线粒体损伤都参与了内皮损伤的进展。线粒体是真核细胞内数量最多、分布最广的细胞器,不仅维持细胞的基础能量代谢,线粒体结构和功能的改变对细胞凋亡起着关键性调控作用。近年来,线粒体依赖的自噬(线粒体自噬)成为研究的热点,线粒体自噬通过对损伤细胞器和蛋白质的自身消化来维持细胞稳态及促进细胞生存,并能通过对凋亡、坏死、衰老的调节决定细胞最终的命运。最新的研究发现线粒体自噬在急性缺血性心血管疾病中发挥重要作用。但线粒体自噬在糖尿病血管病变中是否同样发挥关键的调控作用,目前尚缺乏关键性证据。肾素-血管紧张素(RAS)是最常见及最重要的心脏疾病致病因子。但在血管病变中RAS的活化状态尚存争议,而对不伴心肌病变的糖尿病患者是否需要应用RAS抑制剂目前更是缺乏直接的理论依据。临床试验则证实血管紧张素转化酶抑制剂具有不同程度的血管内皮保护作用,提示RAS可能参与内皮功能损伤的进程。但RAS在体内的确切致病机制目前尚不清楚,近期的研究发现,在心肌肥厚和心衰小鼠中,线粒体氧化应激是RAS的一个值得信赖的靶点。在新生大鼠心肌细胞中,RAS激活的自噬反应是心肌细胞正常发育的必要条件。或许,RAS通过线粒体诱导的自噬反应在糖尿病血管内皮病变中同样发挥关键的调控作用。为了阐明线粒体自噬对高糖诱导内皮细胞损伤的保护作用及其与RAS的相互作用关系,本研究以人脐静脉内皮细胞(HUVEC)、糖尿病大鼠及无心血管、肿瘤并发症的糖尿病患者为实验对象,从组织、细胞及分子水平研究RAS-线粒体对高糖诱导的内皮细胞凋亡、衰老及自噬的影响及作用机制,并对可能的调控因子进行探讨。第一部分：高糖诱导脐静脉内皮细胞损伤的功能研究目的：本研究主要探讨不同葡萄糖浓度或者高葡萄糖浓度下不同作用时间对人脐静脉内皮细胞衰老、自噬及凋亡的影响。方法：1.HUVEC在无血清ECM培养基中培养12小时后,加入不同浓度葡萄糖(11,16.5,22,27.5,33mM)共同作用72h,或者33mmM葡萄糖分别作用72,48,24,6h。ECM培养基基础葡萄糖浓度5.5mM。同时给予33mM甘露醇作为对照排除渗透压升高的影响。2.葡萄糖处理后,分别行细胞周期、β-半乳糖苷酶染色、细胞衰老相关异染色质聚集(SAHF)和衰老相关蛋白检测评估细胞衰老。3.葡萄糖处理后,检测自噬标志蛋白及自噬启动蛋白的表达,并分别给予AICAR、CC调控自噬启动蛋白AMPK,评估葡萄糖对内皮细胞自噬的影响。4.葡萄糖处理后,流式细胞术评估葡萄糖对内皮细胞凋亡的影响。结果：1.葡萄糖呈现浓度及剂量依赖性地促进人脐静脉内皮细胞衰老,且这种促进与渗透压改变无关。2.葡萄糖诱导自噬标志蛋白及自噬启动蛋白的高表达,且独立于渗透压改变。抑制AMPK磷酸化反应可以废除高糖诱导的自噬反应。3.培养条件下,高糖对人脐静脉内皮细胞凋亡无明显影响。结论：本研究表明,高糖可以明显促进内皮细胞衰老、自噬,但对内皮细胞凋亡无明显影响。且内皮细胞损伤为渗透压非依赖性。第二部分：RAS-线粒体损伤在高糖诱导的人脐静脉内皮损伤中的作用研究目的：本研究探讨RAS-线粒体损伤在高糖诱导人脐静脉内皮损伤中发挥的作用。方法：1.葡萄糖处理后,检测ACE1、AGTR1、AGTR2mRNA和蛋白水平变化。2.葡萄糖处理后,分别行线粒体膜电位、活性氧、NADPH、胞浆Ca2+、细胞色素C定位检测评估线粒体功能。3.在HUVEC中加入Ang Ⅱ(1uM)作用72h,模拟33mM葡萄糖作用72h对内皮细胞线粒体损伤、细胞衰老、细胞自噬的影响。4.在HUVEC中分别加入Benazepril(1uM)、Losartan (10uM)作用6h后,与33mM葡萄糖共同孵育72h,检测线粒体损伤、细胞衰老、细胞自噬。5.应用CCCP直接诱导线粒体通透孔开放,观察人脐静脉内皮细胞衰老、自噬及凋亡反应。CCCP与Benazepril及Losartan共同孵育,观察线粒体损伤、细胞凋亡、自噬及衰老反应。结果：1.葡萄糖诱导ACE1、AGTR1mRNA和蛋白的高表达,但对AGTR2的表达无明显改变。2.葡萄糖诱导线粒体膜电位降低、NADPH表达下降、活性氧表达增高、胞浆Ca2+超载、细胞色素C与线粒体解耦连。3. Ang Ⅱ作用72h模拟高糖诱导的线粒体损伤,内皮细胞衰老及自噬反应增力口。4. Benazepril或Losartan可以改善高糖诱导的线粒体损伤及内皮细胞损伤反应。5.线粒体通透孔完全开放可以诱导人脐静脉内皮细胞凋亡、自噬反应高表达。低剂量CCCP对内皮细胞凋亡无影响。6.线粒体通透孔开放完全逆转Benazepril及Losartan对内皮细胞的保护作用。结论：本研究结果表明,葡萄糖通过ACE1、AGTR1的激活诱导线粒体损伤,而线粒体损伤诱发人脐静脉内皮细胞衰老、自噬及凋亡反应增强。第三部分：自噬限制高糖诱导的内皮细胞衰老及凋亡目的：本研究探讨细胞自噬对高糖诱导的人脐静脉内皮细胞衰老和凋亡的影响,同时进一步研究其可能的作用机制。方法：1.在HUVEC中加入不同的自噬抑制剂(3-MA、CC)及自噬激动剂(AICAR、 CCCP)后,观察内皮细胞衰老、凋亡变化情况。2.对自噬小体骨架分子LC3、beclin1分别行siRNA干扰,观察内皮细胞衰老、凋亡。3.3-MA分别与Benazepril及Losartan共同孵育,观察内皮细胞衰老、凋亡。结果：1.3-MA、CC加速高糖诱导的内皮细胞衰老、凋亡,AICAR、CCCP部分逆转高糖诱导的内皮细胞衰老、凋亡。2.LC3、beclin1siRNA干扰促进高糖诱导的内皮细胞衰老,并诱导内皮细胞凋亡。3.3-MA废除Benazepril及Losartan诱导的衰老延迟,并诱导内皮细胞凋亡。结论：本研究表明,自噬限制高糖诱导的人脐静脉内皮细胞衰老及凋亡。第四部分：糖尿病患者及糖尿病大鼠血管内皮中存在自噬标志物、衰老标志分子聚集和衰老细胞表达增加目的：本研究验证自噬、衰老、凋亡在糖尿病患者及糖尿病大鼠动脉血管内皮中的表达情况,并观察Benazepril及Losartan对糖尿病大鼠血管内皮功能的保护作用。方法：1.腹腔注射STZ诱导糖尿病大鼠模型,分别给予benazepril、losartan、生理盐水每日灌胃,持续灌胃8周。2.大鼠麻醉后,检测内皮依赖性血管舒张功能及内皮非依赖性血管舒张功能。3.免疫组化检测糖尿病大鼠血管内皮中自噬标志蛋白的表达。4.ELISA检测糖尿病大鼠血管内皮SA-β-gal表达。5.TUNEL检测糖尿病大鼠血管内皮细胞凋亡。6.Weastern blot检测糖尿病患者动脉内皮细胞自噬、凋亡及衰老标志蛋白的表达。结果：1.糖尿病大鼠动脉内皮依赖性血管舒张功能受损,内皮非依赖性血管舒张功能无明显改变；血管内皮细胞自噬标志蛋白、SA-β-gal表达,TUNEL阳性细胞率上升。2. benazepril、losartan可以改善糖尿病大鼠动脉内皮依赖性血管舒张功能受损,降低血管内皮细胞自噬标志蛋白、SA-β-gal表达,TUNEL阳性细胞率。3.糖尿病患者血管内皮细胞自噬、凋亡及衰老标志蛋白的表达量增高。结论：本研究表明,自噬、衰老、凋亡参与糖尿病患者及糖尿病大鼠动脉血管内皮细胞损伤,抑制RAS可以明显改善糖尿病大鼠血管内皮功能及减轻自噬、衰老、凋亡聚集。