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研究背景及目的在过去的二十年中,非小细胞肺癌(NSCLC)的治疗取得了重要进展。表皮生长因子酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKIs)为表皮生长因子(EGFR)突变患者的生存带来空前益处。FLAURA研究的最新数据显示,奥希替尼一线治疗晚期EGFR突变患者效果惊人。但是,随着药物的广泛长时应用,耐药问题愈发不容忽视。本研究旨在通过对奥希替尼获得性耐药的非小细胞癌进行一系列实验,探讨奥希替尼获得性耐药中的关键分子及具体机制,为开发具有临床应用价值的新靶点提供重要依据。方法1.本研究选取同时含有EGFR敏感突变和耐药突变的非小细胞肺癌细胞系,通过奥希替尼小剂量递增与大剂量冲击的方法构建奥希替尼获得性耐药细胞系。通过转录组测序,差异基因通路富集分析法了解介导获得性耐药的主要信号通路。通过Western Blot法检测奥希替尼耐药前后的PIM1及上皮间质转化(EMT)相关指标在蛋白水平的表达量差异。通过功能学实验检测生物学行为变化。2.构建了3条含靶向PIM1基因的sg RNA,采用CRISPR/CAS9慢病毒系统感染耐药细胞进行PIM1基因敲减。药敏试验检测PIM1敲减后细胞对奥希替尼的敏感度。Western Blot法检测PIM1及上皮间质转化(EMT)相关指标的改变。功能学实验检测生物学行为变化。3.通过Western Blot的方法检测了PIM1敲降后,耐药细胞中TGFβ/SMADs通路的变化。结果1.药敏试验结果证明奥希替尼获得性耐药细胞系构建成功。测序与生信分析结果显示,奥希替尼获得性耐药后,EMT通路激活显著。Western Blot结果显示奥希替尼获得性耐药后,PIM1蛋白显著过表达,上皮指标下调而间质指标上调,呈现明显EMT改变。多类功能学实验结果表明,奥希替尼耐药后,细胞增殖、存活、迁移和侵袭能力明显提高。2.Western Blot检测结果显示PIM1基因敲减效果良好。药敏试验结果显示PIM1敲减可以部分恢复耐药细胞对奥希替尼的敏感性。功能学实验结果显示,PIM1基因敲减后,耐药细胞的增殖、存活、迁移及侵袭能力均有所减弱。且部分耐药后下调的上皮指标(如E-cadherin)有所上调,而几乎所有之前耐药后上调的间质指标(如ZEB1、Twist、Slug、Snail和N-cadherin)均下调,EMT被抑制。3.Western Blot结果显示,耐药前后SMAD2/3的蛋白水平没有明显变化。但是磷酸化的SMAD2/3水平在耐药后上调,PIM1敲降后下调。结论1.非小细胞肺癌细胞奥希替尼获得性耐药后,PIM1表达上升,增殖、存活、迁移及侵袭能力增强,并发生上皮间质转化。2.在非小细胞肺癌奥希替尼获得性耐药细胞中,PIM1基因敲降抑制了上皮间质转化,且相比较耐药细胞增殖、存活、迁移及侵袭能力减弱。3.在非小细胞肺癌奥希替尼获得性耐药细胞中,PIM1基因敲降能部分恢复对奥希替尼的敏感性。4.在非小细胞肺癌奥希替尼获得性耐药细胞中,PIM1基因敲降抑制了TGFβ/SMADs通路。