论文部分内容阅读
第一部分重组异戊烯基转移酶AtPT对10-羟基喜树碱等芳香类化合物的异戊烯基化芳香类化合物异戊烯基转移酶是一类参与合成活性异戊烯基芳香类化合物的关键酶。本课题组前期从曲霉(Aspergillussp.A8-4)中克隆得到芳香类化合物异戊烯基转移酶基因AtPT,体外功能鉴定发现重组异戊烯基转移酶AtPT具有惊人的杂泛性,可作为一种良好的工具酶应用于多种不同结构类型异戊烯基芳香类化合物的酶法合成。本文利用重组异戊烯基转移酶AtPT作为工具酶对喜树碱类化合物、厚朴酚与和厚朴酚及它们的糖苷化衍生物进行异戊烯基化反应,制备了一系列异戊烯基化产物,以期得到药理活性好、生物利用度高、毒性低的衍生物,为新药研发提供先导化合物,取得了如下结果:1.利用重组AtPT对20种芳香类化合物(主要为生物碱类化合物,厚朴酚与和厚朴酚及它们的糖苷化衍生物),3种不同的异戊烯基供体(DMAPP、GPP和FPP)进行异戊烯基化反应筛选,发现重组酶对(1)以厚朴酚为底物,以DMAPP、GPP为供体;(2)以和厚朴酚为底物,以GPP为供体;(3)以10-羟基喜树碱为底物,以GPP、FPP为供体;(4)以9-氨基喜树碱为底物,以GPP为供体能发生异戍烯基化反应,且产物产率较高。2.利用重组AtPT对上述6个异戊烯基化反应进行放大试验,分离纯化制备得到10个厚朴酚及和厚朴酚类化合物的异戊烯基化产物,利用HR-ESI-MS、1D-NMR、2D-NMR等波谱技术对它们的结构进行鉴定,分别为3-(3-dimethylallyl)-magnolol(I),3-dimethylallyl-magnolol(II),2-(O-dimethylallyl-magnolol(III),3-dimethylallyl-3’-(3-dimethylallyl)-magnolol(IV),3,3’-di-(3-dimethylallyl)-magnolol(V),2-O-dimethylallyl-3’-(3-dimethylallyl)-magnolol(VI),3-(3-geranyl)-magnolol(VII),3-geranyl-magnolol(VIII),2-0-(3-geranyl)-honokiol(IX),2-O-geranyl-honokiol(X);得到6个喜树碱类化合物的异戊烯基化产物,利用HR-ESI-MS、NMR等波谱技术对它们进行结构鉴定,分别为 9-geranyl-10-hydroxycamptothecin(XI),10-O-geranyl-camptothecin(XII),9-farnesy l-10-hydroxycamptothecin(XIII),9-amino-10-geranyl-camptothecin(XIV),9-amino-12-geranyl-camptothecin(XV),9-amino-10,12-digeranyl-camptothecin(XVI)。3.重组AtPT酶促动力学分析。考察了上述6个异戊烯基化反应动态,发现反应转化率在40 min内呈线性增长。通过计算米氏常数(Km)和酶反应最大速率(Vmax)对酶反应动力学进行分析,发现重组AtPT在以厚朴酚、和厚朴酚为受体底物时对DMAPP的亲和力比GPP强;以DMAPP为供体时,重组AtPT对厚朴酚的亲和力更强,而以GPP为供体时,对和厚朴酚的亲和力更强。对于喜树碱类化合物,以GPP为供体时,重组AtPT对10-羟基喜树碱的亲和力比9-氨基喜树碱强。第二部分毛霉对柚皮素的硫酸酯化利用毛霉属真菌Mucor sp.对柚皮素(1)进行生物转化得到3个极性增大的产物,经LC-MSn-IT-TOF推测均为柚皮素单硫酸酯产物。对其进行制备生物转化,并合理运用各种色谱技术,得到这3个产物,经NMR波谱进一步分析并鉴定化合物2、3和4分别为柚皮素7-O-硫酸酯、柚皮素4’-O-硫酸酯及柚皮素5-O-硫酸酯。硫酸酯化是药物代谢常见的II相反应,因此,该毛霉可以作为研究柚皮素等化合物理想的微生物代谢模型。