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植物在其生长过程中会遭遇病害、干旱、冷胁迫、盐胁迫等多种生物逆境胁迫和非生物逆境物胁迫,这些胁迫影响植物的生长发育,造成作物减产甚至绝收。植物在进化过程中形成了复杂的胁迫信号转导网络应对逆境胁迫。脱落酸(Abscisic acid,ABA)是植物响应逆境胁迫过程中的重要植物激素。近年来的研究已经在拟南芥(Arabidopsis thaliana)中建立了 ABA-PYL-PP2C-SnRK2信号通路调控模型。但是在二穗短柄草(Brachypodium distachyon)中关于ABA受体PYL家族和A类PP2C亚家族的研究还尚未见报道。二穗短柄草作为一种新型单子叶模式植物,与小麦、水稻、玉米等禾谷类作物亲缘关系较近,对二穗短柄草的基因功能研究能为对这些作物的研究提供参考。本文研究了二穗短柄草A类PP2C在ABA信号通路中的调控作用及其在非生物逆境胁迫应答中的反应。首先分离了二穗短柄草PYL家族和A类PP2C亚家族成员,基于相互作用和转录表达分析结果,选定了 A类PP2C亚家族的成员BdPP2CA6进行深入研究。利用遗传学手段、生化和分子生物学研究方法,探究了 BdPP2CA6在非生物逆境胁迫中的功能和作用机制。主要研究结果如下:1)二穗短柄草PYL家族和A类PP2C亚家族成员的鉴定和生物信息学分析从二穗短柄草全基因组数据库中鉴定出12个BdPYL基因和86个BdPP2C基因,通过系统进化树分析分离出8个二穗短柄草A类PP2C基因BdPP2C4。序列比对分析发现,BdPYL和BdPP2CA各家族成员内部的结构域高度保守,对BdPYL和BdPP2CA基因启动子的顺式作用元件分析发现,BdPP2CA1、BdPP2CA6、BdPP2CA7和BdPP2CA8的启动子区域内含有很多与ABA有关的顺式作用元件,表明它们可能参与ABA信号通路。2)BdPYL和BdPP2CA的相互作用分析成功地克隆出12个BdPYL基因和7个BdPP2CA基因,并将它们分别构建到酵母表达载体pGADT7和pGBKT7中,以研究相互作用关系。发现只有BdPYL11能在没有外源 ABA 的条件下与 BdPP2CA4、BdPP2CA5、BdPP2CA6 或 BdPP2CA8 相互作用。通过双分子荧光互补实验,确认了 BdPYL11与BdPP2CA4、BdPP2CA5、BdPP2CA6或BdPP2CA8在植物体内的相互作用关系。同时只有BdPYL11与BdPP2CA6的复合体定位到细胞核,其余组合均定位到全细胞。因此,我们进一步研究了这五个基因。3)转录表达分析和亚细胞定位分析转录表达分析显示,在ABA、NaCl或PEG6000处理后,BdPYL11表达下调,而BdPP2CA4、d5、BdPP2CA6、BdPP2CA8表达上调。基因枪轰击洋葱表皮细胞的研究表明,BdPYL11、BdPP2CA4、BdPP2CA5和BdPP2CA8定位在细胞核、细胞膜和细胞质,而BdPP2CA6则定位在细胞核。表明BdPP2CA6能将BdPYL11招募到细胞核发挥作用。因此,我们最终选择BdPP2CA6进行基因功能分析,并获得了BdPP2CA 过表达的转基因拟南芥。4)BdP2CA6转基因拟南芥对ABA超敏感使用不同浓度ABA处理拟南芥幼苗发现,与野生型和转空载型拟南芥相比,BdPP2CA6转基因拟南芥幼苗对ABA更敏感,并且敏感程度随ABA浓度提高而升高。ABA瞬时处理拟南芥叶片发现,BdPP2CA6转基因拟南芥叶片的气孔在ABA的刺激下闭合速率更快,表明BdPP2CA6转基因拟南芥对ABA超敏感。5)BdPP2CA6提高转基因拟南芥对盐胁迫耐受性对拟南芥幼苗和成苗进行盐胁迫处理发现BdPP2CA6转基因拟南芥植株对盐胁迫的耐受性更高。同时使用NaCl瞬时处理拟南芥叶片发现,BdPP2CA6转基因拟南芥叶片的气孔在盐处理下闭合速率更快,表明BdPP2CA6提高转基因拟南芥对盐胁迫的耐受性。6)BdP2CA6转基因拟南芥对盐胁迫耐受性的生理分析和相关基因表达分析研究发现BdPP2CA6能显著提高拟南芥体内K+/Na+比,并且是通过提高拟南芥体内K+的积累而不是Na+的积累实现的。对BdPP2CA6转基因拟南芥盐胁迫处理后生理指标的测定表明,BdPP2CA6转基因拟南芥的叶绿素和脯氨酸含量均高于野生型拟南芥植株,而丙二醛含量、双氧水含量和离子渗漏均低于野生型拟南芥。这些结果说明,BdPP2CA6转基因拟南芥在盐胁迫下受到更少的膜损伤和氧化损伤,因而对盐胁迫的耐受性更高。对与ABA信号通路和盐胁迫相关的基因或转录因子基因的表达模式研究表明,ABF2、ABF3、DREB2A、MYB15以及RD26受到盐胁迫后表达上调,并且它们在BdPP2CA6转基因拟南芥中的上调程度显著高于野生型拟南芥,说明BdPP2CA6通过上调一些与ABA信号通路和盐胁迫相关的基因或转录因子的表达,正调控植物响应盐胁迫信号通路。7)BdPP2CA6与AtSnRK2和BdSnRK2之间的相互作用分析为了研究BdPP2CA6在植物非生物胁迫应答中的分子机理,我们研究了BdPP2CA6与AtSnRK2和BdSnRK2之间的相互作用。结果表明BdPP2CA6与AtSnRK2.3之间有较强的相互作用,BdPP2CA6与BdSnRK2.2之间则只有较弱的相互作用,并且我们不能通过双分子荧光互补实验检测出这种较弱的相互作用。因此我们推测BdPP2CA6可能不是通过调节SnRK2来正调控植物对盐胁迫应答和植物体内ABA信号通路。本研究分离并克隆了 A类PP2C基因BdPP2CA6,BdPP2CA6蛋白可以和BdPYL11在没有外源ABA的条件下相互作用并定位在细胞核。过表达BdPP2CA6提高了拟南芥对ABA的敏感度和对盐胁迫的耐受性。我们的研究表明BdPP2CA6正调控转基因拟南芥的ABA信号通路和胁迫应答过程。