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目的:通过研究角质形成细胞、维生素C和胰岛素对成纤维细胞增殖的影响以及维生素C和胰岛素对成纤维细胞体外形成纤维膜的作用,为今后构建不含异种胶原的真皮替代物提供新的方法。方法:(1)用分散酶和胶原酶二步消化法分离人皮肤成纤维细胞,并进行原代培养。(2) MTT法检测维生素C、胰岛素和角质形成细胞培养上清液对成纤维细胞增殖的影响以及成纤维细胞培养上清液对角质形成细胞增殖的影响。(3)成纤维细胞长期体外培养使其形成纤维膜,并通过倒置显微镜和染色对纤维膜进行观察。结果:(1)成纤维细胞接种24 h后,细胞逐渐呈放射状伸展,中心随之扁平,接种2~3 d细胞开始缓慢生长,约5~7 d汇合成片,HE染色和波形蛋白(vimentin)染色证明是成纤维细胞。(2)与对照组相比,低浓度的维生素C(25μg/ml、50μg/ml、75μg/ml)对体外培养的成纤维细胞有促增殖作用(P均<0.05),且50μg/ml浓度组的促增殖作用大于25μg/ml浓度组(P<0.05),而与75μg/ml浓度组相比无统计学差异(P>0.05),但高浓度的维生素C(100μg/ml、125μg/ml)对成纤维细胞生长有明显的抑制作用(P< 0.05),且后者的的抑制作用大于前者(P< 0.05)。(3)胰岛素(2.5μg/ml、5μg/ml、7.5μg/ml和10μg/ml)促进成纤维细胞的增殖(P均<0.05),且5μg/ml浓度组的促增殖作用大于2.5μg/ml浓度组(P<0.05),而后三个浓度组之间差异无显著性(P>0.05),但12.5μg/ml的胰岛素对成纤维细胞有明显抑制增殖作用(P<0.05)。(4)角质形成细胞培养上清液对成纤维细胞的增殖有促进作用,且50%浓度组>25%浓度组>12.5%浓度组(P<0.05),而50%浓度组与75%浓度组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。(5)成纤维细胞培养上清液能促进角质形成细胞的增殖,25%浓度组的促增殖作用大于12.5%浓度组(P< 0.05),但25%、50%和75%各浓度组间比较,差异无统计学意义(P>0.05)。(6)含胰岛素(2.5μg/ml,5μg/ml)或维生素C+胰岛素(50μg/ml的维生素C﹢5μg/ml的胰岛素)的培养基可促进体外培养的成纤维细胞形成纤维膜,且后者形成的纤维膜较前者更厚。(7) HE染色示纤维膜由浅红染色的细胞外基质组成;Masson-trichrome染色结果显示蓝色的胶原纤维。结论:(1)用分散酶和胶原酶二步消化法对成纤维细胞进行原代分离、培养,经HE染色和免疫组化染色鉴定为成纤维细胞。(2)低浓度维生素C(25μg/ml~ 75μg/ml)和胰岛素(2.5μg/ml~10μg/ml)可促进成纤维细胞的生长,而高浓度维生素C(≥100μg/ml)和胰岛素(≥12.5μg/ml)则抑制成纤维细胞增殖,为纤维膜的培养提供了实验方法学依据。(3)角质形成细胞培养上清液可促进成纤维细胞生长,反之亦然。(4)胰岛素或胰岛素+维生素C能促进成纤维细胞体外形成类似于真皮的纤维膜,可用于人工真皮的构建。