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肿瘤的生长和转移需要大量新血管的生成，大量的血管不但为肿瘤生长提供了氧气和营养而且运送清除肿瘤局部产生的代谢产物。因此，阻断肿瘤血管生长可以很好地抑制肿瘤生长，这一理论被称为“肿瘤饥饿疗法”。自Forkman首次提出这一理论以来，学者们陆续发现了大量的血管生成抑制剂。尤其以高效无毒的内源性血管生成抑制剂引人注目。血管能抑素Canstatin是又一新发现的高效内源性血管生成抑制剂，发现以来倍受关注。与此同时我们基于实体肿瘤因局部缺氧而产生大量缺氧诱导因子(Hypoxia inducible factor,HIF)的事实，以及HIF作为转录因子诱导缺氧反应基因表达的特点，试图进行缺氧反应元件(HRE)与Canstatin(Cans)基因重组载体构建，以期建立HIF诱导增强Canstatin基因在肺癌局部高表达体系，从而特异抑制肿瘤的血管生成，达到抑制肿瘤生长的目的，为肿瘤基因治疗探索新途径。 一、本研究的主要内容和研究方法如下： 1．应用RT-PCR法从人肝正常组织中获取Canstatin基因，并将其定向克隆到真核表达载体pCMV-Script中，构建pCMV-Script-Cans重组基因表达载体。命名为重组载体1。 2．在pCMV-Script-Cans重组基因表达载体的基础上，将缺氧反应元件(HRE)连接到该载体中Canstatin基因上游，构建缺氧增强型重组基因表达载体pCMV-Script-3HRE-Cans，命名为重组载体2。 3．RT-PCR法获得癌胚抗原分泌引导肽(CEAS)的cDNA，采用基因重叠延伸法(SOEing)连接组成含有CEAS cDNA的Canstatin cDNA融合基因片段：CEAS-Cans，并将其定向连接到pCMV-Script载体的多克隆位点中，构建Canstatin分泌型重组表达载体，命名为重组载体3。 4．在重组载体3的CEAS上游定向连接HRE，构建缺氧增强分泌表达型重组载体pCMV-Script-3HRE-CEAS-Cans，命名为载体4。 5．脂质体介导以上载体转染人肺腺癌A549细胞株和人脐静脉内皮HUV-EC-C细胞系，荧光定量PCR法检测转染细胞在常氧和缺氧条件下Canstatin mRNA的表达量。第三军医大学博士学位论文采用台盼蓝活细胞记数、平板克隆形成试验、3H一TdR掺入法、流式细胞术、电镜、TuNEL法等方法检测常氧和缺氧条件下不同功能载体对转染细胞的生长、增殖、周期、凋亡等方面的影响。 6.转染各载体基因的人肺癌细胞与亲代人脐静脉内皮细胞在缺氧和常氧条件下混合培养，观察分泌型载体的生物学效应，即对内皮细胞生长与凋亡的作用。 7.各载体转染的人肺腺癌A549细胞及小细胞肺癌H446细胞的培养上清干预鸡胚尿囊绒毛膜(CAM)，观察各载体对血管生成的作用。 8.基因枪转染各载体至负荷肺癌裸鼠肿瘤局部，观察转染后各组裸鼠瘤体积、体重变化，并做肿瘤组织微血管记数来确定各载体对肺癌治疗作用。 二、实验结果如下: 1.从成人癌旁正常组织和胎儿肝脏组织中均克隆到Canstatin基因，测序证实与GenBank中的一致，定向构建的载体pCMv一ScriPt一Cans连接方向、阅读框架正确;测序结果证明s0Eing法构建的片段CEAS一Cans与预期一致，分泌型载体pCMv一scriPt-CEAS一Cans构建正确;缺氧增强型表达载体pCMv一scriPt一3HRE一Cans及缺氧增强分泌型载体pCMv一ScriPt一3HRE一CEAS一Cans构建成功，阅读框架正确。 2.各重组载体转染的肺癌A549细胞和人脐静脉内皮细胞HUV一EC一C均有不同拷贝的canstatin mRNA或CEAs一Cans mRNA表达，在缺氧条件下缺氧增强型和缺氧增强分泌型载体表达量显著增高;与空载体转染组相比，各重组载体转染对人脐静脉内皮细胞的生长、增殖有显著抑制作用，内皮细胞出现G0一Gl期阻滞和显著凋亡。在缺氧条件下尤为明显;各重组载体转染的肺癌细胞在常氧和缺氧条件下生长、增殖、细胞周期、凋亡率等与空载体和未转染组均无显著差异。 3.各重组载体转染的肺腺癌A549细胞和小细胞肺癌H446细胞均表达Canstatin或CEAS一Cans mRNA，与人脐静脉内皮细胞HUV一EC一C混合培养时载体3、4组内皮细胞增殖明显抑制。缺氧条件下，缺氧增强分泌型载体组内皮细胞大量抑制，而非分泌型载体组混合培养内皮细胞在缺氧和常氧条件下生长增殖均与空载体对照组无差别。 4.重组载体转染肺癌A549细胞培养上清干预的CAM血管生成实验中，载体3、4组千预的CAM血管生成明显受到抑制，载体1、2及空载体组和未千预组血管生成旺盛。 5.重组载体基因枪转染裸鼠肿瘤局部，在转染10天后均仍检测到Canstatin基因n1RNA表达。载体1~4组与空载体及未干预组相比瘤体积均显著缩小，微血管数目明第三军医大学博士学位论文显减少，其中载体3、4组尤其明显。 三、研究得出以下结论: 1.本研究克隆的中国人Canstatin基因与国外GenBank中的序列完全一致，是人类基因中较保守的一类基因，可能不具有种属差异。 2.Canstatin具有抑制内皮细胞生长增殖和诱导凋亡的作用，但对肿瘤细胞生长特性无直接影响。 3.本研究构建的Canstatin基因重组载体1一4均可在转染的内皮细胞和肿瘤细胞中表达Canstatin基因，其中HIF介导体系(载体2、4)在缺氧条件下可增强Canstatin基因的表达。表明HIF介导增强Ca