创伤性脑损伤是一个重大的全球公共卫生问题,其发病机制又是一个及其复杂的病理生理过程,涉及一系列的级联反应,其中轴突损伤是轻度、中度和重度创伤性脑损伤中最常见和最重要的病理特征之一,也是创伤性脑损伤致死率和致残率的主要驱动因素。如何调节和实现损伤轴突再生是创伤性脑损伤治疗的一个重要研究方向。成熟中枢神经系统损伤后有限的的轴突再生是由内在再生能力的不足和胶质瘢痕等外部环境抑制性因素共同造成的,其中受损轴突的内在再生能力是中枢神经系统损伤后轴突再生的决定性因素。造成轴突这种再生能力差异的主要因素是中枢神经系统发育的神经元和成熟的神经元之间基因表达的差异。为此,课题组前期通过建立控制性皮层损伤模型,并对损伤周围的组织进行高通量测序,结合生物信息学分析,发现了一个颅脑损伤后差异表达且显著上调的基因SOX11,进一步检索发现SOX11在中枢神经系统损伤特别是创伤性脑损伤中的作用及其机制未见报道。因此,为了研究SOX11对颅脑损伤后皮层神经元轴突再生的作用及其机制,本实验首先建立小鼠控制性皮层损伤模型,观察颅脑损伤急性期轴突的损伤与再生情况,检测SOX11在损伤周围皮层脑组织中的表达情况,初步分析SOX11的表达水平与轴突再生的相关性。其次分离培养小鼠原代皮层神经元,建立皮层神经元牵张损伤模型,通过过表达和敲低SOX11的表达水平,进一步确定SOX11对皮层神经元损伤轴突再生的调控作用。最后通过靶向调控相关信号通路,初步探讨SOX11促进颅脑损伤后皮层神经元轴突再生的作用机制。第一部分颅脑损伤后SOX11的表达与轴突再生相关性分析目的:通过建立小鼠控制性皮层损伤模型,观察颅脑损伤后轴突的损伤和再生情况,探索损伤周围皮层脑组织SOX11的表达水平及时间变化规律,初步分析损伤后皮层脑组织SOX11的表达水平与轴突再生的相关性。方法:建立小鼠控制性皮层损伤模型,分别于伤后1h、6h、12h、24h、48h和72h对损伤周围皮层脑组织进行HE染色、镀银染色以及免疫组化检测β-APP和GAP-43;q RT-PCR和Werstern blot(WB)检测伤后不同时间点损伤周围皮层脑组织SOX11的表达情况;Pearson分析不同时间点损伤周围皮层脑组织SOX11蛋白表达水平与GAP-43蛋白表达水平的相关性。结果:HE染色显示损伤周围皮层脑组织细胞进行性肿胀、坏死和炎症细胞浸润,镀银染色显示损伤周围皮层脑组织轴突进行性增粗、肿胀和断裂。免疫组化检测β-APP显示急性期内损伤周围皮层脑组织中β-APP的表达呈逐渐增加的趋势。GAP-43的免疫组化结果显示控制性皮层损伤3天内损伤周围皮层脑组织中GAP-43的表达逐渐增加。q RT-PCR和WB检测结果显示控制性皮层损伤后急性期损伤周围皮层脑组织中SOX11基因和蛋白的表达随着损伤时间的延长不断增强。而且急性期损伤周围皮层脑组织SOX11的表达水平与GAP-43的表达水平呈显著正相关关系,提示颅脑损伤后SOX11的表达与轴突再生具有很强的相关性。结论:成功通过建立了小鼠控制性皮层损伤模型,发现颅脑损伤急性期伴有广泛的轴突损伤以及损伤轴突再生的自我修复,而且SOX11可能参与了颅脑损伤急性期神经元的修复反应,并与轴突再生有一定的相关性。第二部分SOX11对颅脑损伤后神经元轴突再生的调控作用目的:进一步探索SOX11对颅脑损伤后神经元轴突再生的调控作用,探讨SOX11基因的表达调控是否可以作为增强轴突内在再生能力的靶点。方法:分离培养小鼠原代皮层神经元,并在倒置相差显微镜下观察,利用MAP2和DAPI双荧光鉴定皮层神经元纯度。建立原代皮层神经元牵张损伤模型,并于损伤后1h、6h、12h、24h和48h通过台盼蓝染色计算存活率,检测LDH释放量和流式细胞术评价凋亡率的变化。通过慢病毒过表达和敲低皮层神经元SOX11的表达水平,q RT-PCR和WB检测牵张损伤后24h皮层神经元SOX11、βIII-tubulin和GAP-43的表达,利用βIII-tubulin免疫荧光测量牵张损伤后24h各组皮层神经元轴突的平均长度。结果:小鼠原代皮层神经元培养7天左右,胞体饱满,突起交织成神经网络,逐渐发育成熟,并且皮层神经元纯度大于90%。牵张损伤后1h、6h、12h、24h和48h皮层神经元存活率逐步下降,LDH的释放量和神经元凋亡率呈逐渐增加的趋势。牵张损伤后皮层神经元SOX11、GAP-43和βIII-tubulin的表达水平明显上升,敲低SOX11可以降低牵张损伤后皮层神经元GAP-43和βIII-tubulin的表达和轴突的长度,过表达SOX11可以进一步增加牵张损伤后皮层神经元GAP-43和βIII-tubulin的表达和轴突的长度。结论:成功培养了小鼠原代皮层神经元细胞,并建立了小鼠原代皮层神经元牵张损伤模型,证明了SOX11基因的表达可以作为增强轴突内在再生能力的一个靶点,即可以通过提高SOX11基因的表达水平来促进损伤轴突的再生。第三部分SOX11促进颅脑损伤后神经元轴突再生的机制目的:进一步探索SOX11促进损伤后神经元轴突再生的机制方法:在小鼠原代皮层神经元牵张损伤模型的基础上,通过慢病毒过表达和敲低SOX11的表达水平,q RT-PCR和WB检测皮层神经元中TANK、TRAF2、JNK和DCX的表达。进一步利用慢病毒敲低SOX11、过表达TANK和JNK的抑制剂SP600125处理皮层神经元,q RT-PCR和WB检测皮层神经元中JNK和DCX的表达。最后利用慢病毒过表达和敲低DCX的表达水平,q RT-PCR和WB检测皮层神经元中βIII-tubulin和GAP-43的表达,并利用βIII-tubulin免疫荧光测量牵张损伤后各组皮层神经元轴突的平均长度。结果:qRT-PCR和WB检测结果显示过表达SOX11促进牵张损伤后皮层神经元TANK、TRAF2、JNK和DCX的表达,而敲低SOX11抑制牵张损伤后皮层神经元TANK、TRAF2、JNK和DCX的表达。在敲低SOX11的基础上并过表达TANK,q RT-PCR和WB检测结果显示牵张损伤后皮层神经元JNK通路的激活以及DCX的表达增加,而在敲低SOX11并过表达TANK再加入JNK抑制剂SP600125,抑制牵张损伤后皮层神经元JNK通路的活化,降低DCX的表达。另外过表达DCX组皮层神经元βIII-tubulin和GAP-43的表达明显增加,轴突的长度也显著增加,而敲低DCX组皮层神经元βIII-tubulin和GAP-43的表达明显减少,轴突的长度也显著降低。结论:SOX11通过TANK/TRAF2-JNK-DCX信号通路促进牵张损伤后皮层神经元轴突再生,即牵张损伤后SOX11通过促进皮层神经元TANK和TRAF2的表达,激活JNK通路,进而增强DCX的表达,从而促进轴突的再生。