二十二碳六烯酸高产菌株的选育与发酵工艺研究

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二十二碳六烯酸(Docosahexenoic acid,DHA)是一种具有重要生理功能的长链不饱和脂肪酸,它具有促进婴幼儿大脑发育、保护视力、预防心血管疾病以及提高机体免疫能力等重要生理功能。因此,DHA已广泛使用于婴幼儿食品、保健食品和治疗试剂等。传统DHA资源日益短缺限制了DHA的进一步应用,而微生物发酵法则是解决这一问题的重要方法。本实验室选用裂殖壶菌SR21发酵生产DHA,该菌株具有很强的脂肪酸合成能力,但DHA占总脂肪酸的相对量低。基于上述原因,本文对DHA生产菌株的菌种选育和发酵工艺进行了研究。首先,在摇瓶中考察了培养基组成和培养条件对裂殖壶菌SR21发酵产DHA的影响,并确定了最适培养条件为:葡萄糖9%,玉米浆0.6%,酵母粉0.9%,pH6,人工海水50%,装液量60mL/250mL,种龄30h,接种量5%,培养温度25℃。在此培养条件下培养3天,裂殖壶菌SR21的生物量、总脂肪酸占生物量的含量和DHA占总脂肪酸的含量分别达32.0g/L、64.0%和30.3%。然后,以裂殖壶菌SR21为出发菌株,以碘乙酸、丙二酸和低温作为筛选因子,建立了高效筛选DHA高产突变菌株的方法。分别用硫酸二乙酯(DES)、紫外(UV)和DES-UV复合诱变方法诱变裂殖壶菌SR21,这些诱变后的单菌落经过“平板筛选-试管筛选-摇瓶筛选”最终获得3株产量高于出发菌株的突变菌株(裂殖壶菌D-U-1、D-U-2和D-U-3)。裂殖壶菌D-U-1的DHA占总脂肪酸的比例高达43.5%,比出发菌株提高了45.3%。裂殖壶菌D-U-2和D-U-3比裂殖壶菌D-U-1产量略低,但是发酵周期有所缩短,生产强度相对提高。其中,裂殖壶菌D-U-3生产强度达到125.5mg/L/h,比出发菌株提高了61.9%。结果说明本研究建立的诱变方法能够有效的提高DHA产量和生产强度。最后,在7L发酵罐水平考察了3株高产突变菌株的分批发酵和补料分批发酵过程。在分批发酵实验中,产量最高的是裂殖壶菌D-U-1,发酵时间为3天,其生物量、总脂肪酸占生物量的含量和DHA占总脂肪酸的含量分别达35.5g/L、64.8%和42.8%。生产强度最大的是裂殖壶菌D-U-3,其生产强度与裂殖壶菌SR21相比增加了87.50%。在补料发酵实验中,初始葡萄糖浓度为9%,发酵到48h时,补加300mL饱和葡萄糖溶液,裂殖壶菌D-U-1发酵120h,其生物量和DHA产量分别高达61.5g/L和16.8g/L。
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