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研究背景与目的:缺血性脑卒中是一类严重危害人类健康的疾病,病死率、致残率一直居高不下,如何尽快恢复缺血区的血运是治疗脑卒中的关键。VEGF-Notch信号通路是调控脑缺血后血管新生的主要信号通路,脑缺血后,缺血区脑组织中VEGF、Notch表达上调,并显著促进缺血区毛细血管新生。然而,脑缺血后血管新生是诸多因子参与的一系列相互衔接、相互影响的病生过程,其调控网络十分复杂,有关VEGF-Notch信号通路的上游调控因子仍所知甚少。Mir-210为当前公认的缺氧特异miRNA,体外缺氧环境可刺激其表达稳定上调,进而通过下调其靶基因ephrinA3的蛋白表达,促进内皮细胞形成血管,而缺氧正是脑缺血的病生基础;此外,诸多文献提示Mir-210与VEGF关系密切,在肿瘤细胞中Mir-210与VEGF同步过表达,生物学软件亦预测Mir-210可调控VEGF。脑缺血后,体内缺氧环境下,Mir-210怎样影响VEGF及其下游信号通路对血管新生的调控作用,是阐明Mir-210调控脑缺血后血管新生分子机制的关键所在。本实验拟通过构建大鼠脑缺血模型,检测脑缺血后缺血皮质区不同时间点Mir-210及其靶基因ephrinA3的表达水平,明确脑缺血对Mir-210及其靶基因ephrinA3表达水平的影响;根据体内实验结果,体外过表达Mir-210于HUVE-12内,检测VEGF-Notch信号通路相关分子VEGF、VEGFR2、Notch1的基因和蛋白表达水平,明确Mir-210对VEGF-Notch信号通路的调控作用及途径,进一步阐明Mir-210调控脑缺血后血管新生的分子机制。研究内容和方法:1.体内实验1.1实验分为缺血后1d、3d、7d和假手术组。采用线栓法构建大鼠MCAO模型,前三组分别于缺血后1、3、7天处死大鼠,留取缺血皮质区脑组织待检。假手术组不做缺血处理。1.2采用real time PCR检测脑缺血后不同时间点缺血皮质区Mir-210的表达水平,与假手术组比较,明确脑缺血下Mir-210的动态表达变化。1.3采用RT-PCR法检测脑缺血后不同时间点缺血皮质区ephrinA3的基因表达水平,与假手术组比较,明确脑缺血后ephrinA3的基因表达变化。1.4采用免疫荧光染色法检测脑缺血后不同时间点缺血皮质区ephrinA3阳性细胞数,与假手术组比较,明确脑缺血后ephrinA3的蛋白表达变化。2.体外实验2.1采用贴壁法培养人脐静脉内皮细胞HUVE-12。2.2构建慢病毒载体,将包装LV-Mir-210-GFP及LV-GFP的重组慢病毒转染至HUVE-12;转染72h后,荧光显微镜下观察GFP绿色荧光,计算阳性转染率。实验分为Mir-210过表达组(LV-Mir-210-GFP)和对照组(LV-GFP)。2.3采用real time PCR比较Mir-210过表达组与对照组HUVE-12中Mir-210的表达水平,以明确LV-Mir-210-GFP是否确实能上调Mir-210的表达。2.4采用流式细胞学比较Mir-210过表达组与对照组ephrinA3的蛋白表达水平,明确Mir-210对其靶基因ephrinA3蛋白表达的抑制作用。2.5采用real time PCR、western blot、免疫荧光法比较Mir-210过表达组与对照组VEGF-Notch信号通路相关分子VEGF、VEGFR2、Notch1的mRNA和蛋白表达水平,明确Mir-210对VEGF-Notch信号通路相关分子表达的调控途径。2.6行内皮细胞血管形成实验,比较Mir-210过表达组与对照组内皮细胞血管形成数,进一步明确Mir-210对血管内皮细胞血管形成能力的影响。结果:1.体内实验1.1 Real time PCR结果显示,脑缺血后各实验组Mir‐210表达均高于假手术组,缺血可显著刺激Mir‐210表达水平上调。1.2 RT‐PCR结果显示,脑缺血后各实验组ephrinA3的mRNA表达水平逐步上调。1.3免疫荧光结果显示,脑缺血后各实验组ephrinA3阳性细胞数均低于假手术组,缺血后1、3、7d各缺血皮质区ephrinA3阳性细胞数逐渐降低。以上结果说明,脑缺血可导致Mir‐210的过表达,后者在转录后水平抑制了其靶基因ephrinA3蛋白表达。2.体外实验2.1重组慢病毒转染至HUVE-12,荧光显微镜下可见大部分细胞均表达GFP绿色荧光, GFP阳性细胞率约为80～90%。Real time PCR结果显示,与对照组相比,Mir‐210过表达组Mir‐210上调了32.1±1.26倍。2.2流式细胞学结果显示,Mir‐210过表达可显著抑制其靶基因ephrinA3的蛋白表达。2.3 Real time PCR、western blot和免疫荧光结果显示,与对照组比较,Mir‐210过表达组VEGF、VEGFR2、Notch1的mRNA和蛋白水平均显著上调,证实Mir‐210可上调VEGF‐Notch信号通路的相关分子表达。2.4血管形成实验结果显示,与对照组比较,Mir‐210过表达组HUVE‐12形成的血管管腔数明显增多,表明Mir‐210可进一步促进血管内皮细胞形成血管。结论:体内实验结果表明,脑缺血可促进Mir‐210表达上调,抑制Mir‐210的靶基因ephrinA3的蛋白表达;体外实验结果表明,Mir‐210过表达除可抑制其靶基因ephrinA3的蛋白表达外,还可显著上调VEGF‐Notch信号通路的分子表达水平。研究结果提示,缺血/缺氧可诱导血管内皮细胞中Mir‐210的过表达,Mir‐210可通过VEGF‐Notch信号通路参与缺血损伤后血管新生的调控过程。