南极磷虾壳中虾青素提取纯化与纳米包载

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虾青素具有显著的抗氧化、抗癌、增强免疫力等生物效能。天然虾青素在结构、生物功能、应用效果及生物安全等方面都优于化学合成的虾青素,因此从甲壳动物壳中提取天然虾青素成为近年来的研究热点。南极磷虾作为南大洋中的关键物种,储量丰富,体内富含虾青素,亟待开发利用。以南极磷虾壳作试验材料,采用酶解与有机溶剂萃取相结合的方法,研究探索虾青素的提取工艺。选用二氯甲烷萃取南极磷虾壳中虾青素,以虾青素提取率为指标,响应面试验结果表明最优萃取条件为二氯甲烷萃取料液比为1:5g/mL,萃取温度为30℃,萃取时间为7h,萃取级数为2级,虾青素提取率最高达到131.56μg/g(湿重)。为进一步提高虾青素得率,在二氯甲烷萃取之前采用木瓜蛋白酶进行酶解,设计4因素3水平的响应面试验。结果表明最优酶解条件是酶解pH6.0,酶解温度为54℃,酶解时间为88min,酶底比为2.00%,虾青素提取率最高达到145.04μg/g(湿重),比直接有机溶剂萃取法提高了10.25%。为进一步提高游离虾青素的含量和纯度,对粗提液做进一步分离纯化。首先利用KOH-C2H5OH对粗提液进行皂化反应,将虾青素酯水解成游离虾青素,再利用AB-8大孔树脂进行层析分离。结果表明游离虾青素得率达到369.97μg/g(湿重),比皂化前平均提高了83.3%。利用高效液相法(HPLC)对收集到的样液进行检测,结果表明样液中游离虾青素的纯度达到95.4%。为克服虾青素易受到外界光、热、金属离子等因素的影响而导致异构,提高虾青素的稳定性,引入纳米包载技术。采用卵磷脂、壳聚糖作为纳米载体的材料,通过探头超声作用,使两亲性的卵磷脂/壳聚糖在水溶液中形成单分散性的纳米乳。以纳米乳的平均粒径为响应值,运用响应面法优化试验设计,最终得到最优制备条件为卵磷脂/壳聚糖比重为20:1(w/w),超声时间为16.0min,Tween-80作为乳化剂的系统用量为1.5%(w/v),卵磷脂/壳聚糖纳米乳的平均粒径为121.34nm (n=3)。纳米粒度分析仪测定纳米乳的表面zeta电位是+39.6mV,表明制备的纳米乳是较为理想的载体。利用透射电子显微镜(TEM)进行观察,纳米乳的形态呈球形并且分布均匀。将虾青素包埋到卵磷脂/壳聚糖纳米乳中并进行体外评价。采用纳米包载技术将虾青素包埋后,虾青素纳米乳的粒径变大,表面zeta电位大于+30mV,TEM观察形态呈球形并且分布均匀。随着虾青素投入量的增加,虾青素纳米乳的平均粒径变大,载药量增加,而包封率却降低。体外释放试验表明,虾青素纳米乳具有pH敏感性,在低pH值条件下,虾青素释放较快,在pH7.4下更稳定。稳定性试验表明,与游离虾青素相比,虾青素通过纳米包埋之后不容易异构降解,更加稳定。总还原力试验和抗氧化试验表明,虾青素经过包埋后能够长期有效保持虾青素的总还原力和抗氧化活性。因此虾青素纳米乳应在低温PBS(pH7.4)中保存。
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