水稻(Oryza sativaL.)是重要的粮食作物,其产量高低与我国粮食安全和人民生活密切相关。倒伏严重影响了籽粒的发育和收获,是水稻产量损失的重要影响因子。在引起倒伏的遗传因素中,茎秆机械强度是首要的影响因子。水稻茎秆的机械强度是茎秆粗度、腔壁厚度等形态指标以及茎秆细胞壁发育状态及组分含量的综合体现,这些性状是典型的由多基因控制的数量性状。通过QTL定位的方法,挖掘自然群体中控制影响茎秆机械强度相关性状的有利等位基因,可为选育抗倒伏品种提供可直接利用的基因资源。脆性突变体是研究水稻茎秆机械强度以及细胞壁合成遗传机理的理想材料。目前,通过对一系列脆秆基因的功能研究初步解析了细胞壁合成调控的遗传机理和控制茎秆机械强度的遗传机制,但该机制还有待进一步深入和完善。基于此,本研究利用以籼稻品种9311为供体、粳稻品种日本晴为受体构建的127个染色体片段代换系(Chromosome segment subsitition lines,CSSL),分析并定位了控制茎秆粗度、腔壁厚度、维管束数目以及细胞壁组分等性状的QTLs。同时,为了进一步阐明茎秆强度遗传调控的机制,以3份脆秆突变体为基础材料,定位并克隆了3份脆秆突变体中引起脆性突变的基因,并对相关基因的遗传效应及作用机理进行了初步分析。1、水稻茎秆强度相关性状QTL分析及腔壁厚度QTL-qWTh5的定位以茎秆细胞壁组分含量为指标共检测到19个QTLs,分布于水稻的9条染色体上。其中以纤维素含量为指标时,仅能在第6染色体1.31～1.49 Mb范围内定位到1个具有加性效应的QTL-qCel6,对表型变异的贡献率为10.9%;以木糖含量为指标检测到3个QTLs,分别位于第7、8和10染色体上,对表型变异的贡献率为8～13.6%。其中qXyl7和qXyl10对表型变异的贡献率为负效应,而qXyl8对表型变异的贡献率则为正效应;以阿拉伯糖含量为指标时,共检测到4个QTLs,位于第7和8染色体上,均表现出正向的遗传效应,对表型变异的贡献率为6.4～12.5%;以木糖/阿拉伯糖值为指标时,同样检测到4个具有加性效应的QTLs,分别位于第7和8染色体上;以葡萄糖含量为指标时,共检测到5个具有加性效应的QTLs,位于第1、2、3和11染色体上,对表型变异的贡献率为5.75～17.72%,其中qGlc1-1和qGlc11表现出主效QTL的效应,贡献率分别为17.72%和15.6%;以半乳糖含量为指标时可以检测到2个具有加性效应QTLs,分别位于第4和8染色体上,对表型变异的贡献率分别为8.63%和13.96%。同时为了验证定位QTL的准确性,选择效应值较大的qXyl10和qXA7-1进行分析,两年茎秆细胞壁相关组分含量测定结果表明,qXyl10和qXA7-1能稳定遗传。定位茎秆粗度、腔壁厚度及维管束数目等性状QTLs时,分别以种植在扬州两地(酒甸和校内试验地)的CSSL群体为材料进行分析。以校内种植CSSL群体的茎秆粗度为指标检测到3个QTLs,分别位于第5、6和9染色体上,对表型变异的贡献率为9.23～13.63%,其中qDia5x和qDia6x表现出正向的遗传效应,qDia9x表现出负向的遗传效应;以大小维管束数目为指标各检测到1具有负向的遗传效应个QTLs,分别位于第2和9染色体;以腔壁厚度为指标时检测到2个具有正向的遗传效应QTLs,其中位于第2染色体的QTL-qWTh2x对表型变异的贡献率为20.39%,为控制腔壁厚度的主效QTL。以酒甸种植CSSL群体的茎秆粗度、腔壁厚度以及大小维管束数目为指标时,共检测到5个QTLs,分别位于第2、4、5和6染色体上。其中qLV2j表现出负向的遗传效应,其他QTLs均表现出正向的遗传效应。两地定位结果比较发现,以茎秆腔壁厚度为指标时,检测到一个相同的QTL-qWTh5x/qWTh5j,说明该QTL是一个能稳定遗传的QTL,受环境影响较小。除了定位到1个共同的QTL外,还在相近的物理区段内检测到多个控制同一性状的QTL,这些QTLs定位区间虽然不完全一致,但是根据QTL定位分析方法推测,这些相邻的QTL可能为同一个QTL,值得我们进一步研究。随后基于QTL定位结果开展对QTL-qWTh5的定位。通过对144个不同基因型单株茎秆腔壁厚度测量结果分析表明,QTL-qWTh5与代换系N22第5染色体上携带的供体片段连锁,最终根据交换单株信息将QTL-qWTh5定位于分子标记STS5-9和STS5-12之间,物理距离为1.4Mb。随后结合分子标记辅助选择构建了只包含1.78Mb供体片段的近等基因系NIL-qWTh5。通过对NIL-qWTh5植株茎秆腔壁厚度及部分农艺性状调查发现,NIL-qWTh5植株茎秆的腔壁厚度较受体亲本日本晴显著提高,而抽穗期及株高等农艺性状与日本晴相似,表明腔壁厚度QTL-qWTh5具有成为优质抗倒伏基因的潜力。以上研究结果为分子标记辅助选择抗倒伏育种提供了有利的基因资源,为精细定位和克隆QTL-qWTh5奠定了基础。2、水稻脆秆突变体bc1-wu3、bc-wy7和bc19的鉴定及基因克隆本研究从60Co-γ射线诱变的武育粳3号和武运粳7号后代中分别鉴定到1个脆性突变体bc1-wu3(brittle culmlfrom wuyujing3)和bc-wy7(brittle culm from wuyunjing 7),从EMS诱变的中花11后代中鉴定到1份脆秆突变体bc19(brittle culm 19)。3份脆秆突变体植株的叶片、叶鞘、茎秆等组织在全生育期期间始终表现出脆性,易折断。通过对3份突变体茎秆细胞形态结构观察及茎秆细胞壁组分中相关糖组分含量的测定,明确了3份突变体脆性产生的理化基础;通过遗传分析并利用图位克隆的方法定位并克隆了3份突变体中引起该脆性突变的基因。脆性突变体bc1-wu3与其野生型武育粳3号相比,除了茎秆强度降低外,突变体植株的穗长和粒长长度显著降低,粒宽则显著增加;茎秆细胞壁糖组分测定结果表明,细胞壁组分中纤维素含量极显著下降,而木糖、葡萄糖及阿拉伯糖含量则显著增加;茎秆切片观察发现突变体茎秆的厚壁细胞层数减少,厚壁细胞细胞壁厚度极显著降低。遗传分析表明,bc1-wu3脆性性状受1对隐性核基因控制。采用图位克隆方法将该基因定位于第3染色体分子标记MK12与MK18之间,物理距离为57 Kb,在此定位区段内包含1个已克隆的脆性基因BC1(LOC_Os03g30250)。测序结果表明,突变体bc1-wu3中BC1基因第2外显子内(CDS 659 bp处)有1个碱基的替换(G-T),导致编码的氨基酸由半胱氨酸变异为苯丙氨酸。实时荧光定量PCR结果表明,BC1基因在脆秆突变体bc1-wu3茎秆中的表达量较WT显著降低。据此推断脆秆基因bc1-wu3为BC1基因的新等位基因。相关研究结果加深了对BC1基因功能的认识,有助于阐明水稻茎秆强度的遗传机制。与其野生型武运粳7号相比,脆秆突变体bc-wy7株高变矮、穗粒数减少、穗长变短、生育期推迟,并出现穗包颈的表型;茎秆细胞壁糖组分分析表明,bc-wy7茎秆细胞壁中除纤维素含量显著降低外,葡萄糖含量也显著降低;荧光显微镜观察茎秆切片表明,bc-wy7茎秆表皮层下方厚壁组织及厚壁细胞细胞壁变薄,薄壁细胞呈现变小的趋势,但排列更紧密。遗传分析表明,bc-wy7的脆性性状由1对隐性核基因控制,利用图位克隆方法将该基因定位于第2染色体分子标记S2-52与S2-56间180Kb的物理区段内,该区段内包含1个与茎秆机械强度相关的基因BC3(LOC_Os02g50550)。测序结果表明,突变体bc-wy7中BC3基因第9外显子处有2个碱基缺失,造成移码突变使翻译提前终止;实时荧光定量PCR结果表明,BC3基因在脆秆突变体bc-wy7茎秆、叶片中的表达量均降低。据此推断本研究中的脆秆基因bc-wy7为BC3基因的等位基因。相关研究丰富了对BC3基因功能的认识。与其野生型中花11相比,脆性突变体bc19植株的农艺和产量性状显著变化。无论在扬州还是海南的大田自然生长条件下,突变体bc19植株的株高、分蘖数、穗长、小穗结实率及千粒重等性状均较野生型发生显著性变化;茎秆细胞形态结构观察及细胞壁组分测定结果表明,脆性突变引起茎秆厚壁细胞细胞壁厚度显著降低、细胞壁组分中纤维素和葡萄糖的含量显著下降。遗传分析结果表明,突变体bc19的脆性性状由1对隐性核基因控制,利用图位克隆方法将该基因定位于第5染色体分子标记X31与X56间47 Kb的物理区段内。测序结果表明,在ORF3(LOC_Os05g05200)序列的2572～2573 bp(CDS675～676bp)间插入1个碱基T,碱基插入后造成移码突变使得翻译提前终止,最终使翻译的蛋白质氨基酸链变短;基因表达分析结果表明,BC19基因在突变体植株茎秆、叶片、叶鞘、颖壳中均表达,但表达量均较WT降低。据此推断ORF3-LOC_Os05g05200为突变体bc19的候选基因。利用生物信息学数据库比较分析了BC19基因编码的氨基酸序列,结果表明BC19蛋白在烟草和酵母等物种中是保守的。酵母互补实验结果表明,带有HA标签的互补载体能很好的互补酵母gup1突变体细胞壁缺陷的表型。表明BC19基因的功能与酵母中GUP1基因的功能类似。酵母中GUP1基因编码氧-乙酰化转移酶,其参与到GPI-ANCHOR的形成。突变体bc19中目标基因突变后影响了 GPI锚的磷脂酰合成,从而造成蛋白无法完成GPI锚定修饰,进而影响细胞壁的生物合成。水稻中BC1及其类似蛋白是GPI锚定蛋白,它们突变造成水稻脆秆的表型。我们推测,BC19基因突变影响了 BC1等蛋白的GPI锚定,使其不能被正确定位到细胞膜和细胞壁上,从而造成细胞壁合成缺陷和脆秆的表型。上述结果为深入了解BC19基因在水稻细胞壁合成调控的遗传机制提供了重要的参考。