【摘 要】
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MicroRNAs是一类进化上非常保守的在转录后水平上调节基因表达的小的非编码RNA并且在骨骼肌发育中起到了至关重要的调控作用。本实验室之前的研究发现,牛miR-543在秦川牛胎牛和成年牛背最长肌中差异表达（Sun et al.,2013）,而miR-543在肌生成中所起的调节作用未见报导。所以在本研究中我们分析了miR-543在秦川牛不同发育时期的不同组织中的表达情况；构建了miR-543高效的
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MicroRNAs是一类进化上非常保守的在转录后水平上调节基因表达的小的非编码RNA并且在骨骼肌发育中起到了至关重要的调控作用。本实验室之前的研究发现,牛miR-543在秦川牛胎牛和成年牛背最长肌中差异表达（Sun et al.,2013）,而miR-543在肌生成中所起的调节作用未见报导。所以在本研究中我们分析了miR-543在秦川牛不同发育时期的不同组织中的表达情况；构建了miR-543高效的过表达载体；转染了C2C12细胞并研究miR-543过表达对C2C12细胞增殖及分化的影响；对miR-543的靶基因Wnt7a基因进行了遗传变异的分析。主要成果如下：1.对miR-543在秦川牛不同时期的不同组织中的定量验证发现,miR-543在胎牛肌肉中表达量最高,犊牛和成年牛肌肉中表达量很低。在组织特异性方面,除肌肉组织之外,miR-543在不同发育时期的肝脏和肾脏这两个代谢器官中也有着比较高的表达量,但是在其余组织中表达量都很低,这就说明miR-543的表达有着较好的组织特异性。2.本研究构建了5个不同长度pri-miRNA-543（707bp,509bp,378bp,200bp,120bp）真核过表达载体（pAdTrack/CMV）,转染293T细胞后定量验证miR-543的表达量,结果发现200bp的pri-miRNA-543表达量最高。虽然200bp的pri-miR-543表达量最高,但是与707bp及378bp相比,差异并不显著（P>0.05）,而509bp的pri-miR-543表达量特别低。3.将pAdTrack/CMV-pri-miR-543（200bp）转染C2C12细胞后分别用生长培养基（GM）或分化培养基（DM）培养,然后对miR-543以及肌肉细胞增殖和分化标志基因的表达情况进行定量检测。结果表明miR-543成功过表达且差异极显著（P<0.001）。将过表达miR-543的C2C12细胞使用GM培养基培养发现细胞增殖标志基因Ki67表达量上升,说明miR-543对细胞增殖有促进作用。将过表达miR-543的C2C12细胞用DM培养基诱导分化后发现,肌肉细胞分化标志基因MHC、MyoD和Myf5表达量上升,且差异显著或极显著（P<0.05或P<0.01）,说明miR-543可以促进肌肉细胞分化。综上,miR-543在肌肉细胞增殖和分化方面扮演重要的上调角色。4.对Wnt7a基因的3’UTR区的序列进行分析发现,miR-543与Wnt7a基因的3’UTR区有一个结合区,推测wnt7a基因可能是miR-543的潜在靶基因。而且Wnt7a基因对肌肉的再生有着调控作用,且（?）wnt7a基因以及其遗传变异方面的研究尚无文献报导,所以这部分研究采用DNA池测序技术和PCR-RFLP技术,第一次对Wnt7a基因在中国秦川牛群体中的多态性进行研究,并对所发现的SNPs与生长性状进行关联性分析。秦川牛的Wnt7a基因上共发现3个SNPs（g.T4926C, g.A21943G和g.C63777T）,其中g.C63777T位于第四外显子上,属于错义突变（Arg>Cys）。这三个SNPs均处于Hardy-Weinberg不平衡状态且均为中度多态。g.T4926C和g.A21943G对秦川牛的各项生长性状均无显著影响,g.C63777T对秦川牛的体长、体重,胸宽以及十字部高的影响差异显著或极显著（P<0.05或P<0.01）。在秦川牛的Wnt7a基因上共发现了五种单倍型,数量最多的单倍型为单倍型H1（TAC和CGC）。组合基因型与生长性状关联分析发现由单倍型H1组合的组合基因型H1H1个体与其他组合基因型个体相比在体长、体重,胸宽以及十字部高上差异显著（P<0.01或P<0.05）。
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