南方根结线虫免疫抑制效应子的筛选和功能鉴定

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根结线虫(Meloidogyne spp.)是一类定居性内寄生线虫,每年在农业生产中造成巨大的经济损失。南方根结线虫寄主范围十分广泛,在侵染植物的过程中,会分泌一些效应子来帮助自身实现成功侵染。南方根结线虫的效应子主要是在线虫的食道腺中合成,通过口针分泌到寄主植物细胞中。本研究基于南方根结线虫的基因组信息,预测了 110个具有信号肽,无跨膜结构且具有核定位信号的候选效应子。利用谷枯菌-pEDV系统在烟草进行初步筛选,观察这些效应子能否抑制谷枯菌在烟草上形成的过敏性坏死反应。随后利用原位杂交,TRV介导的RNAi和植物内源表达RNAi等技术对初步筛选出的免疫抑制效应子进行功能验证,本文得出的结论如下:首先利用pEDV载体,借助于谷枯菌(Burkholderia glumae)的三型分泌系统分泌候选效应子,筛选出了六个能抑制谷枯菌在烟草上形成的过敏性坏死反应的效应子。利用实时荧光定量PCR技术,对这六个效应子在线虫侵染不同时期的表达模式进行分析,发现MiISE2,MiISE10在侵染初期表达量很低,但是在侵染后期上调表达;而MiISE5,MiISE6,MiISE9和MiISE23四个效应子在线虫侵染初期上调表达。由于大多数与侵染相关的效应子都是在线虫侵染初期上调表达,因此在后续研究中主要聚焦于MiISE5,MiISE6这两个效应子。原位杂交试验证明这两个效应子都定位于线虫的亚腹食道腺中。分别利用稻瘟菌系统和酵母分泌实验证明MiISE5和MiISE6的信号肽与分泌相关。其次,为了进一步确定效应子的亚细胞定位,将携带有MiISE6::GFP的农杆菌在烟草叶片上进行注射,24-48 h后在激光共聚焦显微镜下观察MiISE6的亚细胞定位,我们发现,MiISE6定位于烟草的细胞核,且第二段NLS与MiISE6的核定位相关。利用拟南芥原生质体转化的技术将MiISE5::GFP转入拟南芥原生质体中,24 h后在激光共聚焦下观察,发现MiISE5定位于拟南芥原生质体的细胞质中。通过植物内源RNAi及烟草脆裂病毒(TRV)介导的RNAi分别敲低MiISE6和MiISE5,与对照相比,线虫的侵染率下降;但将MiISE6和MiISE5分别在拟南芥中进行超表达,会使线虫的侵染率增加。最后,为了分析效应子对植物信号通路的影响,对野生型和转基因突变体分别进行转录组测序并分析差异基因,结合GO和KEGG富集分析的方法,我们发现这两个效应子在拟南芥中的超表达干扰了植物的多种信号通路,可能都是通过抑制茉莉酸防卫反应来促进线虫的侵染。综上,通过对南方根结线虫免疫抑制效应子的筛选及其功能的验证,为深入揭示根结线虫-寄主互作提供了重要的线索,且为南方根结线虫的防治提供了新的思路。
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