细胞凋亡是一个高度调控和复杂的细胞程序性死亡过程,它对细胞的生长和增殖具有极其重要的意义。细胞凋亡异常会导致许多疾病,如神经退行性疾病、自身免疫性疾病和癌症,因此建立一系列简单、快速、灵敏的细胞凋亡相关物质的分析检测方法对揭示细胞凋亡过程以及疾病诊疗具有重要意义。基于共振能量转移(resonance energy transfer,RET)的荧光成像分析具有简单、直观、灵敏和高时空分辨率等优点,已经被广泛应用于生化分析和临床诊断中。然而传统的RET体系往往一个供体对应一个受体,RET效率较低。作为一种新型的二维碳纳米材料,氧化石墨烯(graphene oxide,GO)不仅具有毒性低、比表面积大、易功能化等优点,而且包含大量的共轭π电子,可以通过氢键和π-π堆积吸附单链DNA,有效猝灭其表面的荧光团,因此以GO为RET体系中的能量受体,建立一系列简单、灵敏、准确的RET分析方法,对于细胞凋亡的实时监控具有重要意义。理想情况下,单链DNA可以被GO稳定吸附,仅可以通过识别目标物从GO表面解吸附。然而,在物理吸附系统中,单链DNA与GO的相互作用往往易受生物分子竞争的影响,从而造成假阳性信号。基于此,本文具体开展了一下三个方面的研究内容:1.DNA/氧化石墨烯能量转移纳米复合探针用于miR-21的精准检测。单链DNA通过物理吸附与GO结合,容易被复杂生物样品中的非靶分子解吸附,产生假阳性信号。基于单个碱基水平上嘌呤比嘧啶能被GO更紧密得吸附,我们以GO为受体,将FAM修饰的探针DNA(miR-21的互补DNA序列)与桥染料Cy3修饰的捕获DNA(cDNA)杂交形成双链DNA,通过聚腺嘌呤(poly-adenine,poly-A)将该双链DNA稳定地锚定在GO上,以提高GO物理吸附DNA探针的抗干扰能力。在FAM的激发光下,FAM与Cy3之间发生FRET,同时Cy3与GO之间会发生LrRET,从而导致FAM的荧光猝灭。随着miR-21浓度的增加,FAM的荧光逐渐恢复,并在1-400 nM浓度范围内呈现良好的线性关系,检测限为0.668nM(3σ/k)。当在复杂生物样品中检测时,可以利用FAM与Cy3之间的FRET,通过观察Cy3信号是否恢复来判断纳米探针是否发生非特异性解吸附,实现对细胞凋亡相关miR-21的高准确度检测,避免了非特异性吸附造成的假阳性信号。2.DNA/氧化石墨烯双重能量转移纳米复合探针用于细胞凋亡相关miRNA的低背景精准监测。传统的RET体系往往一个供体对应一个受体,供受体之间能量转移效率低,导致这些RET纳米探针在细胞成像分析中存在背景信号高、灵敏度低的问题。基于GO和黑洞猝灭剂(Black hole quencher,BHQ)都是有效的猝灭剂,我们构建了基于GO和BHQ的单供体-双受体RET纳米探针,提高了能量转移效率,降低了探针的背景。另一方面,将该探针与poly-A抗干扰策略相结合,利用poly-A与GO的较强的结合能力,将双链DNA较为稳定地吸附在GO表面,作为探针抗干扰的第一重保险。同时,利用供体与BHQ之间的FRET,最大限度地降低了由于可能的poly-A DNA非特异性解吸导致的假阳性信号,作为探针抗干扰的第二重保险,有效提高了探针在复杂生物样品中检测时的准确度。基于GO和BHQ的双受体设计以及GO和poly-A的双保险设计,该探针实现了对细胞凋亡相关miR-630和miR-21的低背景、高准确度和高选择性同时监测,其中miR-630和miR-21的线性范围分别为0.5-150 nM和0.5-100 nM,检测限分别为0.25 nM(3σ/k)和0.12 nM(3σ/k)。值得注意的是,该纳米探针首次实现了原位动态监测A549细胞凋亡过程中miR-630的变化,发现在凋亡开始的120 min,miR-630的表达呈上调趋势。该方法简单快捷,有很大的潜力用于复杂生物样品中各种标志物的精准检测和成像。3.DNA/氧化石墨烯双重能量转移纳米复合探针用于癌细胞的靶向成像及细胞凋亡过程的精准监测。在低背景、高准确性和高选择性DNA/GO双重能量转移纳米复合探针的基础上,为赋予探针在对癌细胞的靶向成像能力,我们将Atto425修饰的核仁素核酸适配体(AS1411)和BHQ1-DNA杂交,并通过poly-A将该双链DNA负载在GO上。当AS1411识别癌细胞表面过表达的核仁素后,AS1411从GO表面脱离,Atto425的荧光恢复,从而实现了癌细胞的精准靶向成像。同时,将Cy5修饰的细胞色素c(cytochrome c,Cyt c)核酸适配体和BHQ2-DNA杂交,通过poly-A将双链DNA负载在石墨烯上。随着Cyt c浓度的增加,Cy5的荧光逐渐恢复,并在0.05-1μM浓度范围内呈现良好的线性关系,检测限为40 nM(3σ/k)。通过实时监测癌细胞凋亡过程中Cyt c的变化,实现了监控细胞凋亡的目的。该设计应用于细胞凋亡成像分析中,有望用于癌症的精准诊断及细胞凋亡相关抗癌药物的评价与筛选。综上所述,本研究以细胞凋亡为研究对象,以共振能量转移为技术手段,构建了以GO为能量受体的纳米探针。通过在石墨烯物理吸附DNA能量转移纳米探针中引入poly-A和桥染料Cy3,提高了此类物理吸附探针探针的抗干扰能力,实现对细胞凋亡相关miR-21的高准确度检测。通过构建基于GO-BHQ的单供体-双受体RET纳米探针,提高了能量转移效率,降低了探针的背景。同时在引入poly-A的基础上,通过BHQ对荧光染料的有效猝灭,避免了由于可能的poly-A DNA非特异性解吸导致的假阳性信号,进一步提高了这类物理吸附探针在分析检测中的准确度。该方法被成功用于对细胞凋亡相关的miR-630和miR-21的低背景、高准确性、高选择性同时监测和成像。在GO-BHQ的单供体-双受体RET纳米探针设计的基础上,我们在探针中引入了核仁素和Cyt c的核酸适配体,并应用于细胞凋亡分析检测中,可用于癌症的精准诊断及细胞凋亡过程的精准监测。本研究具有普适性,通过适当替换探针,便能够应用于其他靶物的分析中,同时也为低背景、高准确度能量转移体系的构建和细胞凋亡相关标志物的分析检测提供了新思路。