论文部分内容阅读
目的：研究在中华仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cell，CHO)真核表达系统中CTLA-4／IgG4融合蛋白的表达，将质粒pMMGR和pMM-CTLA4-IgG4／WG共转染CHO／DG44细胞；纯化所表达的CTLA-4／IgG4G4融合蛋白，并从中筛选出表达量最高的阳性克隆细胞，为CTLA-4／IgG4的功能研究和临床应用奠定基础。方法：以限制性酶NdeⅠ和NotⅠ分别对质粒pMMGR和质粒pMM-CTLA4-IgG4／WG进行限制性酶切消化使其线性化，将线性化的质粒pMMGR和pMM-CTLA4-IgG4／WG共转染CHO／DG44细胞，经G418和MTX筛选14天后，对阳性克隆进行无血清悬浮培养，Western blot检测细胞培养液中CTLA-4／IgG4融合蛋白的表达，筛选出高效稳定表达CTLA-4／IgG4融合蛋白的CHO细胞；Protein A-Agarose亲和层析纯化所表达的CTLA-4／IgG4融合蛋白；SDS-PAGE电泳、Western印迹等对纯化的CTLA-4／IgG4融合蛋白的相对分子质量、纯度、抗原特异性进行生物学鉴定。结果：筛选出了能高效稳定表达CTLA-4／IgG4融合蛋白的CHO细胞；纯化后的CTLA-4／IgG4融合蛋白在SDS-PAGE电泳后出现一条与预期分子量大小相符的蛋白条带；该蛋白能与羊抗人IgG-HRP抗体特异结合。结论：获得了能够表达CTLA-4／IgG4融合蛋白的阳性克隆CHO／DG44细胞；这种细胞经MTX梯度浓度加压筛选后能够高效表达CTLA-4／IgG4融合蛋白。