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半纤维素是植物细胞壁的主要组成成分,是自然界含量第二丰富的生物质,广泛应用在食品、饲料、能源及制浆造纸等行业中。半纤维素的如何高效降解与利用一直是行业关注的重大问题,虽然已有β-木聚糖酶、β-甘露聚糖酶发挥一定的降解功效,但基于半纤维素复杂结构,其仍需深入研究包括α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、阿魏酸酯酶、乙酰木聚糖酯酶和α-半乳糖苷酶等半纤维素侧链降解酶和β-木糖苷酶、β-甘露糖苷酶等外切糖苷酶在半纤维素完全降解上的协同作用。本研究的目的是针对饲料原料中半纤维素复杂的化学结构,挖掘具有饲料工业应用价值的半纤维素降解外切糖苷酶和侧链降解酶。通过研究它们和β-木聚糖酶、β-甘露聚糖酶的协同作用,筛选出一个高效的半纤维素降解酶体系,提高饲料原料中的半纤维素降解效率,从而提高饲料原料的利用率,缓解我国饲料产量大,饲料原料紧缺和人畜争粮的局面。具体研究内容和结论如下:(1)由于β-木聚糖酶只能将半纤维素降解成低聚糖产物,而其要降解为单糖还需要β-木糖苷酶的进一步降解。本研究挖掘了6个来源嗜热微生物的β-木糖苷酶在毕赤酵母中重组表达。其中,来源Humicola insolens、Thermomyces lanuginosus、Paecilomyces thermophila和Aspergillus niger的β-木糖苷酶(Hixyl43A、Tlxyl43A、Ptxyl43A和An Xln D)获得较高的表达水平,分别为537.4 U/m L、354.7 U/m L和445.2 U/m L和900.9 U/m L。重组Hixyl43A、Ptxyl43A、Tlxyl43A和An Xln D与Xyn11A(Neocallimastix patriciarum的β-木聚糖酶)对小麦麸皮水解协同效果显著。在Xyn11A基础上,水解过程中木糖的释放量分别提高了101%、98%、97%和18%。综合比较重组表达水平、酶学性质以及协同效果,Hixyl43A最具有在饲料工业中应用潜力。(2)木聚糖主链上的阿拉伯呋喃糖侧链降低了β-木聚糖酶对半纤维素的降解效率,本研究对6个不同微生物来源的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶进行了基因优化并在毕赤酵母中重组表达,通过酶学性质筛选高活性高稳定性的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶用于降解半纤维素的阿拉伯糖呋喃糖侧链。其中,Humicola insolens和Bifidobacterium adolescentis来源的Hiabf43B和de Ax在毕赤酵母中重组表达水平为分别为3.69 g/L和3.89 g/L,发酵活力分别为73.1 U/m L和38.7 U/m L。Hiabf43B和de Ax与Xyn11A、Hixyl43A协同水解小麦麸皮,具有显著的协同效应。两者同时添加,在Xyn11A和Hixyl43A的基础上木糖释放量提高56.2%。(3)为了进一步提高木聚糖的降解效率,本研究在上述糖苷酶的基础上挖掘了降解木聚糖主链上阿魏酸和乙酰取代基侧链的阿魏酸酯酶和乙酰木聚糖酯酶,其中来源于A.niger的阿魏酸酯酶An Fae A和来源于Talaromyces purpureogenus乙酰木聚糖酯酶Tp AXEI通过基因优化后,在毕赤酵母中实现高效表达,重组菌株在7 L发酵罐中蛋白产量分别为12.63 g/L和10.70 g/L,发酵酶活力为190 U/m L和450 U/m L。重组An Fae A和Tp AXEI与Hiabf43B、de Ax、Hixyl43A、Xyn11A协同水解小麦麸皮,具有显著的促进作用,和不添加这两种酶比较,木糖释放量提高了9.8%,还原糖提高10.8%。(4)为了提高半纤维素中甘露聚糖的降解效率,本研究从耐热真菌Lichtheimia ramosa基因组中挖掘到三个耐热的甘露聚糖水解酶Lrman5A、Lrman5B和Lr Agal36A,并首次在毕赤酵母中重组表达,重组菌株在7 L发酵罐产酶水平分别为4.30 g/L、8.36 g/L和4.36 g/L,最高酶活分别为27.9 U/m L、8228 U/m L和953.6 U/m L。Lr Man5A、Lrman5B和Lr Agal36A协同水解甘露聚糖和富含甘露聚糖原料,能够显著的增加甘露糖和还原糖的释放量,提高半纤维素的降解效率。鉴于其良好的酶学性质和水解性质,Lrman5A、Lrman5B以及Lr Agal36A可能在食品和饲料加工领域具有潜在的应用。(5)在断奶仔猪的喂养日粮中添加本研究筛选的半纤维素降解酶体系,在半纤维素降解的内切酶的基础上,饲料的干物质消化率(DMD)提升了6.16%,平均日增重(ADG,Average daily gain)提高了4.6%,料肉比(FCR,Feed conversion ratio)降低了4.2%,腹泻率降低了61.7%,初步验证了在断奶仔猪的饲料日粮中额外添加半纤维素侧链降解酶和外切糖苷酶可以提高饲料利用率,改善动物的生长性能,为下一代饲料酶的开发提供了新的思路。