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目的运用线粒体COII基因、核糖体18S rDNA和28S rDNA分子标记对云南西北7个不同地理种群的特新蚤遗传多样性及遗传分化进行分析,揭示特新蚤不同地理种群的遗传差异,初步探讨特新蚤亚种分化的分子机制及分类地位,构建云南特新蚤生物学和遗传信息的数据库,为进一步研究特新蚤系统分类及鼠疫的防治提供分子生物学依据。方法1、样本采集:采集云南西北德钦、维西、香格里拉、云龙、剑川、玉龙和贡山7个地理区域的特新蚤,根据形态学特征鉴定特新蚤。2、DNA提取:将蚤切割成头、胸、腹三段,按QIAGEN血液、组织DNA提取试剂盒说明书进行操作,提完DNA后保留蚤未被消化的几丁质壳。3、PCR扩增:扩增特新蚤线粒体COⅡ基因和核糖体18S rDNA、28S rDNA。4、电泳:PCR扩增产物采用1.2%琼脂糖凝胶电泳,凝胶成像仪观察结果。5、序列测定与分析:将测序成功的序列进行人工校正与拼接,运用Clustal X1.8 软件、MEGA6.0 软件、DnaSP5.0 软件、Network 4.6 软件、Arlequinv3.1 软件进行序列分析。结果1.共获取61份蚤样本的线粒体COⅡ基因序列,有8份样本的碱基差异较大,共检测到193个变异位点,定义43个单倍型,COII基因单倍型NJ系统发育树显示,单倍型Hap11、Hap13、Hap14、Hap24与外群宽新蚤明显聚为一大支,单倍型Hap40、Hap25、Hap41聚为一支,其余单倍型聚为一个大支,各分支的蚤遗传距离为0.00190～0.02126,各分支间的遗传距离为0.08578～0.17654,大于0.02。2.53份特新蚤线粒体COII基因序列共检测到73个变异位点,定义36个单倍型,总体和大部分地理种群的单倍型多样性Hd>0.5、核苷酸多样性Pi>0.005,群体呈现出单倍型多样性与核苷酸多样性均较高的模式。3.特新蚤7个地理种群的群体内遗传距离均小于0.02,平均遗传距离为0.01986,大部分地理种群间的遗传距离大于0.02,且遗传分化系数Fst大于0.25,基因交流水平Nm值小于1,各地理种群的遗传变异较大。4.在单倍型网络图和NJ系统发育树中,特新蚤的三个亚种并没有形成相对应的亚种聚集,各个地理种群的单倍型分布与其所在的地理种群之间也没有显示出明显的对应关系,处于一种较为混杂的分布格局,并未形成明显的系统地理格局。5.AMOVA分析结果显示,特新蚤各地理种群的群体内变异(63.53%)大于种群间(31.58%)及亚种间的变异(4.89%)。三个亚种间的Nm值为4.86561,亚种内各地理种群间Nm值为0.50283,种群内的Nm值为0.43546。错配分析计算出SSD和HR参数的P值均大于0.05,Tajima’D值(-0.4078)与Fu’sFs值(-9.8681)均为负数。6.7个地理种群的样本蚤的核糖体DNA18SrDNA、28SrDNA序列仅4个和5个碱基的差异,遗传变异非常小,通过18S rDNA和28S rDNA序列比对可以区分特新蚤和棕形额蚤。结论1.线粒体COⅡ基因是特新蚤一个较为理想的分子标记,该序列可提供丰富的遗传多样性信息,能够有效鉴别特新蚤并进行种内遗传分析。2.通过线粒体COⅡ基因分析,云南西北地区不同地理种群间的特新蚤存在较大的遗传变异,群体具有丰富的遗传多样性。3.基于线粒体COⅡ基因的序列分析与基于形态学鉴定的特新蚤三个亚种的分类地位不吻合,特新蚤是否存在三个亚种,还需进行进一步的确定和分析。4.核糖体18S rDNA、28S rDNA序列相对保守,不适合做特新蚤种内不同地理种群的遗传多样性分析。