论文部分内容阅读
microRNA(miRNA)是一类非编码的内源小RNA,它在各种生物学过程中都发挥着重要作用。已有的研究表明在包括癌症在内的多种疾病中均存在miRNA表达失控的现象。近年来在对肝癌产生及发展的分子机制研究中发现,多种miRNA均与肝癌的发生以及后续进程相关。nicroRNA-7(miR-7)是新近发现的—种具有抑癌作用的miRNA,在脑胶质瘤和乳腺癌中能够有效地抑制肿瘤生长,但是miR-7在肝癌进程中扮演的角色尚不明了。本论文以miR-7为研究对象,基于已有的研究成果通过解析其参与调控的信号通路,探索miR-7参与肝癌进程调控的分子机制,为其未来的临床应用提供理论依据。在本研究中,通过对miR-7的靶基因进行生物信息学分析和双荧光素酶报告系统检测,首次筛选并鉴定了一个全新的靶基因PIK3CD,该基因是PI3K/Akt信号通路的重要成分之一并且与细胞增殖以及迁移能力的调控密切相关。体外实验的结果表明,在PIK3CD mRNA的3’UTR中存在4个miR-7的靶位点,miR-7通过与之结合在转录后水平上调控该基因的表达。在肝癌细胞QGY-7703中瞬时或稳定过表达miR-7均能特异性地抑制PIK3CD的表达而不影响其他PI3K亚基成分的表达。通过观察miR-7稳转亚克隆肝癌细胞系的细胞周期变化,发现稳定过表达miR-7能有效地在G0-G1期阻滞肝癌细胞周期进程,并将肝癌细胞的细胞周期时程延长2～4小时。体外细胞增殖实验的结果表明过表达miR-7能有效抑制肝癌细胞的增殖。同时,对于肝癌细胞侵润和迁移能力的分析显示,在体外过表达miR-7能显著降低肝癌细胞的迁移能力。在进一步考察了过表达miR-7对于整个PI3K/Akt信号通路表达的影响后,发现过表达miR-7能显著降低Akt、mTOR以及p70S6K的表达,同时上调4EBP1的表达。此外,通过对上述PI3K/Akt信号通路中的主要成分进行生物信息学分析和双荧光素酶报告系统检测,我们发现其中两个主要成分mTOR和p70S6K同样受miR-7特异性调控,暗示了miR-7在对该信号通路的调控中发挥重要作用。在在体实验中,通过建立皮下植瘤小鼠模型,发现稳定表达miR-7能有效减缓肿瘤生长(肿瘤体积减小约3.5倍)。在肝癌转移小鼠模型中,稳定表达miR-7能够有效抑制肝癌肺转移(肺部表面的肿瘤结节数量减少了32倍)。在皮下生长肿瘤组织以及肝癌肺转移结节中,通过对miR-7和PI3K/Akt信号通路中主要成分的表达分析发现两者之间依然存在良好的负相关性。在对肝癌临床样本的相关指标检测中同样显示miR-7表达与PI3K/Akt信号通路的表达呈负相关并且与肝癌进程密切相关。上述研究结果提示miR-7在肝癌中发挥着抑癌基因的作用,通过靶向调控PI3K/Akt/mTOR信号通路miR-7在体外、体内均能有效地抑制肝癌的生长和转移。本研究对nicroRNA参与调控肝癌发生发展的分子机制提出了一种全新的假说,同时也提示了其在肝癌诊断、预后及靶向治疗中潜在的应用前景。