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马产业是我国近年来大力扶持的产业,研究国内地方特色马种的耐粗饲生物学特性,对于提高饲草料的利用率,促进我国马产业的转型升级和可持续发展具有重要意义。蒙古马原产于蒙古高原,是世界上较古老的草原马种,是中国重要的、优秀的地方马品种资源之一,具有较强的适应性、抗病性和耐粗饲等优良特征。蒙古马的耐粗饲性必然与其独特的胃肠道微生物密切相关。为了进一步揭示蒙古马耐粗饲特性的相关机制,本研究从蒙古马胃肠道的细菌种群组成多样性,纤维素分解菌株的筛选分离,纤维素酶的酶学特性,纤维素酶基因的密码子优化、克隆,以及表达纤维素酶的食品级工程乳酸菌的构建等方面进行了较为全面而系统的研究,试验结果如下:(1)采用Thermo Ion S5 XL平台,利用高通量测序技术研究在草原上自由放牧的5匹蒙古马胃肠道6个不同区段(胃、空肠、回肠、盲肠、腹结肠和背结肠)中的细菌群落组成及多样性,发现从蒙古马胃肠道内容物中得到的细菌16S rDNA V3～V4高变区获得可注释信息的reads数目为1 355 813个,平均为45 194个,OTUs聚类数目(相似性为97%)为24602个,平均为820个。蒙古马胃肠道不同部位的微生物群落均存在着显著性差异,胃中微生物组成在马匹个体之间差异最大,小肠和大肠之间微生物组成划分明显,盲肠和结肠内微生物结构相似。在前肠道内容物中以厚壁菌门(Firmicutes,65%)和变形菌门(Proteobacteria,23%)比例最高,后肠道则以厚壁菌门(Firmicutes,45%)和拟杆菌门(Bacteroidetes,42%)为主。在科水平上,后肠道微生物主要包括瘤胃菌科(Ruminococcaceae,P=0.203)、毛螺菌科(Lachnospiraceae,P=0.157)、理研菌科(Rikenellaceae,P=0.122)、普雷沃氏菌科(Prevotellaceae,P=0.068)。在属水平上,盲肠中纤维杆菌属(Fibrobacter)和腹结肠中瘤胃球菌属(Ruminococcus)等纤维素降解菌的相对丰度高于胃肠道其他部位,说明发酵植物性纤维的主要部位在后肠。.腹结肠中与机体健康相关的Akkermansiaspp.(5.7%)相对丰度较高。在功能预测方面,蒙古马胃肠道中微生物功能丰度在不同部位比例相似,这也许能够表征蒙古马特有的胃肠道微生物结构。可见,蒙古马的食草性和适应性不仅与其独特的胃肠道微生物群落结构有关,还可能与长期采食并消化粗饲料而形成的特殊生理有关。(2)采用羧甲基纤维素钠(CMC-Na)平板法和刚果红染色法从蒙古马盲肠内容物中分离、筛选纤维素降解菌,获得了2株能高效降解纤维素的细菌,经革兰氏染色、生理生化鉴定以及16S rDNA PCR及序列分析分别鉴定为Microbacterium arborescens(树状微杆菌 C6)和Bacillus amyloliquefaciens C14(解淀粉芽孢杆菌C14)。树状微杆菌C6生长速度慢,发酵周期长,对数期为8～120 h,稳定期为120～124 h,124 h以后逐渐下降;解淀粉芽孢杆菌C14生长速度快,接种后8～36 h进入对数期,36 h以后进入稳定期,未见衰退期。解淀粉芽孢杆菌C14产生的纤维素酶反应的最适条件为pH值4.8、55℃和反应5 min,有较强的耐酸碱性和热稳定性,有较好的深度开发和纤维素酶工业化的生产潜力。(3)从蒙古马源解淀粉芽孢杆菌C14基因组DNA中克隆到纤维素酶基因egl-BA，长度为1 500 bp,编码499个氨基酸。序列分析预示,纤维素酶基因egl-BA所编码的纤维素酶是由跨膜结构域(transmembrane region,7～29 aa)、纤维素酶的结构功能域(cellulase,50～297 aa)和N末端的纤维素结合结构域区域(CBM-3,356～437 aa)组成的,含有信号肽的亲水、分泌型、空间结构较复杂的蛋白质。最后,以乳酸菌为宿主对该基因进行密码子优化,为后期的异源表达奠定了基础。(4)成功构建具有纤维素降解能力的食品级工程乳酸菌NN1-EGL(pMG36e-Emr+p32+usp45+melA+NisI+egl)；其酶活力为 0.92 U/m L,高于原始菌株(0.60 U/mL)。为后续食品级工程菌的进一步研制奠定了基础,也为其产业化开发提供必要的试验依据。