杂色鲍MNK、IRR和FGFR基因的克隆、表达分析及与生长相关的SNP位点筛查

来源 :厦门大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:wanglx199085
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杂色鲍(Haliotis diversicolor)是我国南方重要的养殖鲍种,研究与杂色鲍生长相关的基因,分析基因的表达规律,并筛查基因中与生长性状相关联的SNP位点,对于深入了解生长性状调控的分子机制,培育具有优良性状的新品种具有重要意义。本研究将MAPK互作激酶(MAP kinase-interacting kinase,MNK)、胰岛素相关多肽受体(Insulin-related peptide receptor, IRR)和成纤维细胞生长因子受体(Fibroblast growth factor receptor, FGFR)三个基因作为杂色鲍生长的候选基因,通过对其克隆、功能验证、SNP位点检测及与生长性状的关联分析,筛选出对杂色鲍生长性状有重要影响的功能分子标记,以期为杂色鲍的分子标记辅助选择育种提供重要依据。主要结果如下:  1、利用PCR及末端快速扩增技术(RACE)技术,克隆获得MNK基因的cDNA全长序列及开放阅读框(ORF)区域的基因组DNA序列。MNK基因cDNA全长3576bp,ORF长1413bp,ORF区的基因组DNA序列长3942bp,包含6个外显子和5个内含子。荧光定量PCR(qRT-PCR)结果显示,MNK基因在所测的幼体/胚胎不同发育阶段及成体不同组织都有表达,胚胎时期表达量显著高于破膜后幼体时期的表达量,在成体精巢组织中表达量最高,在鳃中表达量最低。通过整体原位杂交实验发现,MNK基因在原肠胚时期至围口壳幼体时期均有表达,担轮幼体时期和面盘幼体早期,MNK基因主要在壳腺区域表达,面盘幼体中期主要在内脏团和贝壳处表达,面盘幼体后期,表达部位分布在内脏团和外套膜区,到达围口壳幼体时期,开始在消化腺、外套膜和足部大量表达。利用高通量测序手段在6个包含MNK外显子的片段中共筛选获得了5个与杂色鲍生长性状相关的SNP位点。选择与足肌重量和壳的生长性状均显著相关的位点A1748C,分析MNK基因在该位点三种基因型的足肌和外套膜中表达量的相互关系,发现足肌重量及壳长、壳宽、壳高、壳重值最高的CC型个体中MNK基因在足肌和外套膜中的表达量最高,而生长性状平均值最低的AA型个体,MNK基因在足肌和外套膜中的表达量最低,说明A1748C中等位基因C可能促进足肌肉及壳的生长。  2、利用PCR技术及RACE技术,克隆获得IRR基因的cDNA全长序列及 ORF区的部分基因组DNA序列。IRR基因cDNA全长5723bp,ORF长3054bp,已获得的ORF区的部分基因组DNA包含18个外显子。通过qRT-PCR检测了IRR基因在杂色鲍胚胎/幼体不同发育时期及成体不同组织的表达情况,发现杂色鲍IRR基因在幼体各发育阶段都有表达,在胚胎发育时期表达量较高,原肠胚时期和早期担轮幼体时期达到最高,担轮幼体时期表达量有所降低,从面盘幼体时期至围口壳幼体时期,表达量显著下降。IRR基因在成体各组织中均有表达,在精巢中表达量最高,在卵巢中表达量最低。整体原位杂交结果显示,IRR基因从原肠胚时期开始表达,担轮幼体期,IRR基因在后毛轮区表达,面盘幼体早期,开始在壳腺处表达,面盘幼体中期,表达部位分布在内脏团和贝壳处,至面盘幼体后期,信号增强,主要集中于内脏团区,到达围口壳幼体时期,IRR基因在消化腺表达量减少,并开始在外套膜和足部表达。利用高通量测序手段在18个包含IRR外显子的片段中共筛选获得了17个与杂色鲍生长性状相关的SNP位点。其中8个位点与所测的杂色鲍性状均明显相关,其余位点与一个或几个生长性状相关联。选择与足肌重量和壳的生长性状均显著相关的A2198T位点,分析IRR基因在该位点三种基因型的足肌和外套膜中表达量的相互关系,发现足肌重量及壳长、壳宽、壳高、壳重值最高的AA型个体中,IRR基因在足肌和外套膜中表达量最高,而生长性状平均值最低的TT型个体,IRR基因在足肌和外套膜中的表达量最低。进一步验证了A2198T位点与杂色鲍生长性状的相关性。  3、利用普通PCR技术及RACE技术获得了FGFR基因的cDNA全长序列及ORF区的部分基因组DNA序列。FGFR基因cDNA全长5059 bp,ORF长3729bp,ORF区基因组DNA中的外显子已全部获得,共包含23个外显子。通过qRT-PCR检测了FGFR在杂色鲍胚胎/幼体不同发育时期及成体不同组织的表达情况,发现FGFR基因在所测的幼体/胚胎不同发育阶段均有表达,在受精卵时期表达量较高,2细胞期开始降低,至围口壳幼体时期表达量又显著升高。在杂色鲍成体各组织中,FGFR基因在鳃、外套膜、肝胰腺、足肌、精巢组织中均有表达,其中,鳃和外套膜中表达量最高,而在卵巢和血淋巴中几乎不表达。利用高通量测序手段在24个包含FGFR外显子的片段中共筛选获得了21个与杂色鲍生长性状相关的SNP位点。选择与杂色鲍壳的生长性状显著相关的位点T15641G,分析FGFR基因在该位点三种基因型外套膜中的表达水平,发现在壳长、壳宽、壳重值最高的TT型个体中,FGFR基因的表达量最低,而在壳长、壳宽、壳重值最低的GG型个体中,该基因的表达量反而最高,TG型个体壳的生长性状值及表达量均介于TT型个GG型个体之间。提示杂色鲍FGFR基因可能参与贝壳形成的负性调控。
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