【摘 要】
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本文首次证明了金黄色葡萄球菌可以产甲酸脱氢酶,通过设计引物,利用PCR技术扩增出目的基因并成功导入大肠杆菌表达系统;选用NdeⅠ与XhoⅠ为酶切位点,将目的基因连接到pET-28a
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本文首次证明了金黄色葡萄球菌可以产甲酸脱氢酶,通过设计引物,利用PCR技术扩增出目的基因并成功导入大肠杆菌表达系统;选用NdeⅠ与XhoⅠ为酶切位点,将目的基因连接到pET-28a(+)克隆载体上,构建pET-28a(+)-FDH(formate dehydrogenase)重组质粒。纯化上,采用 pH 7.5 的100 mmol/L的PBS作为缓冲液,冲洗杂蛋白的Washing-Buffer咪唑浓度为20 mmol/L,洗脱目的蛋白的咪唑浓度为500 mmol/L。酶学性质方面,该甲酸脱氢酶的最适pH值为6.5,在pH 6.5的PBS缓冲液保存24 h的情况下,酶活基本不损失;温度方面,该FDH最适温度达到50℃,70℃保存2 h仍能保留40%以上的残余酶活;通过酶的半衰期可知,该FDH酶活衰变到相对最大酶活一半是所需的时间为864 min;纯化的甲酸脱氢酶的比活力为9.4 U/mg,1 mL反应体系酶的添加量为0.01 mg;米氏常数分别为:Km NAD+=54 μmol/L、Km 甲酸=4.5 mmol/L。根据测得的酶学条件为基础,研究重组菌的发酵条件。培养基成分如下:葡萄糖 15 g/L、NH4Cl 5 g/L、Na2HPO4 3.43 g/L、NaH2PO4 0.57 g/L、NaCl 0.5 g/L、MgSO4 0.2 g/L、微量元素 2 mL/L。摇瓶装液量为50 mL、接种量为2%、发酵初始pH为7.5。诱导时间选择在对数生长前期、诱导剂浓度为0.4 mmol/L IPTG、诱导后培养时间为6 h、诱导温度为28℃。通过培养条件的优化,最终得到的发酵总活力为0.36 U/mL、比活力为0.17 U/mg。发酵后的菌群密度OD600从3.0提升到3.3,提高了 10%。
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