论文部分内容阅读
菊花(Chrysanthemum grandiflorum (Ramat.) Kitam.)是我国十大传统名花和世界四大切花之一,观赏和经济价值极高,但切花菊设施周年生产过程中,普遍存在氮肥过度施用、氮肥利用率低和氮素损失严重等问题,严重影响切花产量与品质,并导致水系统富营养化及土壤次生盐渍化。目前,有关菊花氮素营养研究还仅限于氮素水平／形态对其生长影响。菊花硝态氮运输分子机制研究可以为氮素高效利用,提高切花菊产量与品质提供理论基础。本研究包括：从16个南农系列切花品种中筛选出氮高效吸收切花菊品种‘南农雪峰’；克隆了CmNRT2家族7个基因,命名为CmNRT2.1-2.7,并克隆了CmNRT1.1基因和CmNAR2.1基因；通过TAIL-PCR结合Anchored-PCR方法克隆了CmNRT2.1、CmNRT2.4、CmNRT1.1和CmNAR2.1基因的启动子；利用GeNorm软件分析菊花中稳定的内参基因,发现psaA基因在生物胁迫和非生物胁迫下都相对稳定；通过qRT-PCR方法研究了菊花CmNRT基因的表达特性；通过泛素分裂化系统酵母双杂交和双分子荧光互补实验证实CmNAR2.1和CmNRT2.1、CmNRT2.4存在互作关系；超表达CmNAR2.1、CmNRT2.1和CmNRT2.4基因,对拟南芥生理指标及根系形态的分析；构建RNAi干扰载体转化切花菊‘神马’,获得转基因株系,主要研究结果如下：1.以本实验室自主选育的16个南农系列切花菊品种为试验材料,利用石英砂为基质进行砂培,营养液为改良的休伊特营养液(大量)加Arnon营养液(微量),通过对植株浇灌低氮水平营养液(16mg/L)和正常氮水平营养液(320mg/L),3周之后测定植株干重,叶绿素含量和全氮量,通过比较相对干物质重,相对含氮量和相对叶绿素含量,初步确定‘南农小丽’、‘南农雪峰’和‘南农玉珠’为氮利用效率相对较高的品种,‘南农霞光’、‘南农宫粉’、‘南农花脸’为氮利用效率较低的品种。仍然以相对干物质重,相对含氮量和相对叶绿素含量为评判标准,进一步进行营养液培养复筛,比较初筛的6个品种,最终确定1个氮高效利用品种‘南农雪峰’和1个氮低效利用品种‘南农宫粉’。2.以‘南农雪峰’为研究材料,利用兼并引物RT-PCR和RACE-PCR方法分离出7个CmNRT2基因家族成员,命名为CmNRT2.1-2.7。同时扩增了CmNRT2基因家族成员的基因组DNA序列。利用DNAman软件及MatGAT2.01程序对家族成员氨基酸序列进行相似性比较及进化分析,发现CmNRT2.5和CmNRT2.7与其它5个成员氨基酸差异性较大。利用相同方法克隆获得2个CmNRT类基因的cDNA全长,经NCBI数据库Blast比对命名为CmNRT1.1和CmNAR2.1.CmNRTl.l基因编码587个氨基酸,CmNAR2.1基因编码199个氨基酸,分别对两个基因做了氨基酸序列同源性比对和聚类分析,发现CmNRT1.1蛋白与双子叶植物大豆(GmNRTl.1-like)进化关系上最接近,CmNAR2.1蛋白与双子叶植物拟南芥(AtNAR2.1、AtNAR2.2),百脉根(LjNAR2.1)和黄瓜(CsNAR2)的等聚为一个亚群。这些表明,我们分离的CmNRTs基因为硝酸盐转运蛋白基因。3.利用TAIL-PCR结合Anchored PCR方法从菊花基因组中克隆获得了CmNRTl.1、 CmNRT2.1、CmNRT2.4和CmNAR2.1(CmNRT3.1)基因上游启动子序列,长度分别为1096bp、1658bp、1413bp和1683bp,并对其结构和功能元件进行预测分析,发现4个CmNRTs基因的上游启动子序列中除含有典型的真核生物核心启动子结构外,还包含硝酸盐诱导的调控元件、氮代谢调控元件以及多个胁迫响应和激素应答相关的调控元件,同时启动子间还包含许多相同的调控元件,表明基因可能受到共同调控。4.利用geNorm软件评估了菊花中8个候选内参基因在生物胁迫和非生物胁迫下的稳定性,八个候选内参基因分别为：tubulin (alpha-2,4tubulin)、actin、 EFl a (elongation factor1α)、UBC (ubiquitin C)、GAPDH (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)、 psaA (photosynthesis-related plastid gene representing photosystem Ⅰ)、 PP2Acs (catalytic subunit of protein phosphatase2A)和PGK(phosphoglycerate kinase).广泛使用的EF1α基因在蚜虫胁迫下表现稳定,但是涝胁迫下不稳定。PP2Acs基因为在热胁迫下和涝害胁迫下最稳定的内参基因之一,但在蚜虫胁迫下最不稳定。在三种胁迫下,常用的actin基因都不是最稳定的。psaA基因在生物胁迫和非生物胁迫下都相对稳定。5.利用荧光定量PCR方法对CmNRT2.1、CmNRT2.4和CmNAR2.1基因的表达特性进行了分析。结果表明,CmNRT2.1、CmNRT2.4和CmNAR2.1均受硝酸盐诱导型表达,其中CmNAR2.1、CmNRT2.4为组成型诱导型表达基因。铵盐作为植物体另一种氮源,可以诱导CmNRT2.1和CmNRT2.4的表达,但会抑制CmNAR2.1的表达。谷氨酰胺作为另一种还原性氮,能抑制硝酸盐对CmNRT2.1、CmNRT2.4和CmNAR2.1的诱导表达。6.构建了酵母表达载体pBT3-C-CmNAR2.1和pPR3-N-CmNRT2.1、pPR3-N-CmNRT2.4,利用分裂泛素化系统证明了CmNAR2.1与CmNRT2.1、CmNRT2.4互作。为验证酵母实验结果,进行了BiFC (bimolecular fluorescence complementation双分子荧光互补)实验,结果表明CmNAR2.1与CmNRT2.1、CmNRT2.4之间确实存在互作关系。在分析CmNAR2.1和OsNAR2.1、AtNAR2.1、HvNAR2.3氨基酸序列的基础上,将CmNAR2.1进行氨基酸分段,初步证明了153－199氨基酸是CmNAR2.1和CmNRT2.4互作的关键区域,这些初步证明菊花中协同作用蛋白CmNAR2.1可以辅助高亲和运输蛋白CmNAR2.1和CmNRT2.4运输硝酸盐。7.构建了植物正义表达载体pCAMBIA1301-220-CmNAR2.1和pCAMBIA1301-220-CmNRT2.1、pCAMBIA1301-220-CmNRT2.4载体,利用农杆菌介导法转化野生型拟南芥(Col-0),通过潮霉素抗性、GUS染色、RT-PCR、qRT-PCR筛选鉴定阳性苗,每个基因选取两个转基因表达量高的株系(T3代)进一步分析。结果表明,转CmNRT2.1和CmNRT2.4基因拟南芥地上部鲜重,地下部鲜重以及地上部鲜重与地下部鲜重比值均高于野生型拟南芥；两个CmNRT2.1转基因株系的地上部,地下部硝酸盐含量均高于野生型；但是35S:CmNRT2.4-3株系的地上部,地下部硝酸盐含量高于野生型,35S:CmNRT2.4-7却低于野生型。转CmNAR2.1株系在固体培养基生长8-14天,主根较野生型更长,侧根发生明显优于野生型。我们认为CmNRT2.1和CmNRT2.4具硝酸盐转运功能,CmNAR2.1可能调控根系发育。