研究背景和目的原发性肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma, HCC),是一种严重影响人类健康的恶性肿瘤,是全球第五位最常见恶性肿瘤,第三位最常见肿瘤相关性死亡原因。在我国每年肝癌的发病率为20.4/10万,其死亡率高居癌症死亡率的第二位。目前,手术切除是公认治疗HCC首选和最有效的治疗方法,但是大多数肝癌患者的手术切除率低,且术后复发转移率高,加上肝癌细胞对放化疗的敏感性差,肝癌患者的5年生存率仍处于极低水平,因此寻找新的治疗方法迫在眉睫。近年来,随着一些高效低毒的化疗新药陆续问世和不同机理药物的联合应用使得晚期HCC系统化疗取得了新的突破。EACH等研究证明了含奥沙利铂的FOLFOX4方案系统化疗能为晚期HCC患者带来局部控制和生存获益。奥沙利铂(OXA)为第三代铂类制剂,临床疗效确切、毒副反应较小且易于控制；氟尿嘧啶(5-FU)也是临床上广泛应用的化疗药物。化疗作为一种重要的肿瘤治疗方法,在提倡足量、联合化疗的同时,化疗药物对正常组织的急性和蓄积性毒性限制了它的剂量和使用时间。而低剂量化疗(low-dose chemotherapy)无明显化疗毒副反应,对机体免疫系统也无明显的抑制作用,反而能够提高某些效应细胞的免疫活性。同时,化疗、免疫治疗的不同作用机制使得序贯性免疫化疗(sequential immunochemotherapy)成为一种新的治疗理念。随着肿瘤免疫学和分子生物学的迅速发展,肿瘤生物治疗已成为肿瘤治疗的第四种模式,显示了良好的应用前景。肿瘤免疫学说认为,肿瘤的发生、发展与机体的免疫功能缺陷密切相关。进一步研究发现,导致此缺陷的原因在于机体对成熟DC的功能下调。肿瘤微环境中DC的抗原提呈功能受到抑制,不能进行有效的抗原提呈。树突状细胞(Dendritic cells, DCs)是目前已知的体内功能最强大的、唯一能激活初始T细胞(Naive T cells)的专职抗原提呈细胞(APC),在T细胞抗肿瘤免疫应答的启动、调控过程中起着关键作用。采用各种形式肿瘤抗原修饰DC,然后回输体内,激活T细胞,产生强大的抗肿瘤免疫效应,从而解决因DC功能缺陷造成的肿瘤免疫逃逸。传统体外用肿瘤抗原负载DC的细胞治疗方法其缺陷在于抗原肽在DC上的存在时间短,仅能诱导有限的T细胞克隆,细胞免疫原性低等。我们前期的研究结果证实：以AAV为载体,将肿瘤抗原基因负载DC,能够上调DC表面标志CD1a、HLA-DR、 CD40、CD80、CD83、CD86等的表达,诱导抗原特异性的CTL,增强其杀伤活性。以DC为基础的基因细胞免疫治疗已成为肿瘤生物治疗领域新的研究热点,其抗肿瘤机制是通过激活体内免疫系统,尤其是细胞毒T淋巴细胞特异性杀伤肿瘤细胞,而不损伤正常组织和细胞。临床研究表明,树突状细胞疫苗在前列腺癌、黑色素瘤、肾癌、恶性淋巴瘤等肿瘤免疫治疗中取得了令人鼓舞的疗效。尤其是前列腺癌DC疫苗的研究,2010年4月29日,美国FDA批准了丹德里昂公司(Dendreon)生产的前列腺癌的治疗性疫苗(Provenge)上市。以DC为基础的肿瘤疫苗被认为是最具潜能的肿瘤免疫治疗手段,但是,目前DC疫苗在肝癌等大多数恶性肿瘤中只取得了有限的临床疗效。研究发现,肿瘤细胞表面可以表达多种与肿瘤免疫逃逸相关的抑制性细胞因子,如IL-10、VEGFTGF-β、PGE2等,而且肿瘤细胞表面肿瘤抗原分子和MHC-Ⅰ类分子表达下调或缺失,这些机制都会导致肿瘤的免疫逃逸。重要的是,这些表型已经与肿瘤临床预后不佳密切相关。而且,DC细胞免疫治疗的目标仍然在于消除肿瘤微小转移灶,控制肿瘤的复发和转移,在肿瘤负荷高或者肿瘤免疫原性较低的条件下,疗效有限。因此,多种治疗方法尤其是传统疗法与新兴的免疫疗法的联合应用必将成为肿瘤治疗的趋势。化疗、免疫治疗的不同作用机制使得序贯性免疫化疗成为一种新的治疗理念,受到人们的关注。某些细胞毒性药物能够通过改变肿瘤微环境来调节肿瘤免疫逃逸的机制,从而促进激活CD8+CTL的活性。如何制定规范化、个体化、毒副作用小的化疗联合免疫治疗方案是今后研究的主要方向。本研究观察低剂量化疗联合基因修饰的树突状细胞疫苗对肝癌细胞的体外杀伤作用,以期产生“1+1>2”的协同作用效果,并探讨其协同作用机制,为肝癌的综合治疗提供新的思路和实验依据。方法1.化疗药物OXA与5-FU对肝癌细胞HepG2表达免疫相关分子的影响应用MTT法检测化疗药物OXA与5-FU对HepG2增殖的抑制作用,台盼蓝染色检测经化疗药物作用后的HepG2细胞活性,选择对细胞无明显毒性,抑制率小于30%的低剂量的化疗药物(5μg/ml的OXA和20μg/ml的5-FU),预处理HepG2细胞24h后,分别收集细胞和培养上清,用流式细胞仪检测HepG2细胞表面HLA-A2的表达比例；Western blot检测HepG2细胞bcl-2蛋白的表达变化；ELISA法检测HepG2细胞培养上清中IL-10含量。2.重组腺相关病毒转染DC、诱导CTL及免疫功能检测2.1AAV/AFP感染DC并诱导CTL无菌抽取HLA-A2基因亚型的健康志愿者外周血,采用Ficoll密度梯度法分离外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC),将细胞接种于10cm细胞培养皿中,以AIM-V培养基培养。贴壁5h后,轻轻洗去悬浮的淋巴细胞,剩余贴壁的细胞即为DC前体细胞,用AAV/AFP感染(MOI为100),感染8h后弃上清,换液为新鲜的的AIM-V培养基,并依次加入GM-CSF、IL-4和TNF-α,隔天半量换液。培养至第6天,收获成熟的树突状细胞(DC),计数,并按比例与T淋巴细胞混合(DC:T细胞=1：20),继续以含IL-2、IL-7的AIM-V培养基共培养7天,收获活化的细胞毒性T细胞(CTL)。2.2AAV/AFP感染DC的效率及DC表面分子表型检测AAV/AFP感染DC前体细胞,培养6天后收集成熟DC细胞,采用流式细胞仪检测rAAV/AFP感染DC的效率及AFP在DC中的表达情况；同时用流式细胞仪检测DC表面分子表型CD40、CD80、CD83、CD86、HLA-DR的表达情况。2.3DC分泌IL-10、IL-12细胞因子检测收集DC培养第3天(imDC)、第6天(mDC)的上清液,用ELISA法检测培养上清液中IL-10、IL-12p70的含量。2.4FACS检测T细胞亚群的免疫表型收集DC与T细胞按比例混合培养后第8天(即培养第14天)的CTL细胞,应用流式细胞仪分析T淋巴细胞亚群(CD4+、CD8+、CD8+CD28+、CD8+CD69+、CD8+CD28-)和CD4+CD25+FoxP3+Treg的表达水平变化。3.化疗联合基因修饰的树突状细胞对靶细胞的体外杀伤效应3.1化疗药物处理的HepG2细胞刺激CTL分泌IFN-y的检测HepG2细胞分别经5μg/ml的OXA、20gg/ml的5-FU、5μg/ml的OXA+20μg/ml的5-FU作用后24h后收集各组细胞,然后与CTL细胞按效靶比20:1比例混合培养24h后,收集各组细胞培养上清,用ELISA法检测上清液中IFN-γ的含量。3.2LDH法检测CTL对不同处理组靶细胞的杀伤率实验分为化疗组(OXA+5-FU),DC/CTL组和化疗联合DC/CTL组(联合组)。化疗组：5μg/ml的OXA+20μg/ml的5-FU作用24h的HepG2细胞；DC/CTL组：按效靶比为20:1的比例混合CTL与HepG2细胞；联合组：药物浓度和效靶比同上。采用乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测各实验组对靶细胞HepG2细胞杀伤率(按LDH-Cytotoxicity试剂盒说明书操作)。同时为验证CTL细胞杀伤的MHC限制性,靶细胞与鼠抗人HLA Class Ⅰ mAb(W6/32)(终浓度50μg/ml)共育1h后再进行细胞毒性试验。另外,用K562细胞作为靶细胞,观察自然杀伤细胞(NK)的杀伤活性；同时取AFP阴性的SW480、LNcap-FGC、Hs578T、 Hela细胞作为阴性对照,观察CTL细胞非特异性杀伤情况。4.统计学分析采用SPSS19.0进行统计学分析,计量资料以均数±标准差(X±S)表示。化疗药物对HepG2表达免疫相关分子的影响和体外杀伤实验采用单因素方差分析(one-way ANOVA)比较各组间差异,多个实验组与对照组均数的多重比较采用Dunnett-t检验,多个实验组均数间的多重比较采用LSD-t检验：T淋巴细胞亚群分析采用独立样本t检验；化疗药物对细胞生长抑制、DC分泌细胞因子检测采用析因设计的方差分析,P<0.05为有统计学差异。结果1.化疗药物OXA和5-FU对HepG2细胞的作用效应MTT法检测发现不同浓度的OXA和5-FU对HepG2细胞均有抑制作用,其作用具有呈剂量和时间依赖性。同一浓度不同时间各组之间均有显著性差异(F=3302.56,P<0.001),在相同浓度下48h抑制率明显高于24h；同一时间不同浓度各组之间也有显著性差异(F=394.571,P<0.001);药物浓度和作用时间的交互效应不显著(F=1.690,P=0.155)。OXA和5-FU经MTT测定后,选用51μg/ml的OXA和20μg/ml的5-FU低剂量化疗药物进行后续实验。台盼蓝染色检测显示：该剂量的化疗药物对HepG2细胞作用24-48h无明显细胞毒性,细胞活力都在85%以上,但都对HepG2细胞增殖有明显的抑制作用。2.化疗药物OXA与5-FU对HepG2表达免疫相关分子的影响HepG2细胞经低剂量的OXA和5-FU作用24h后,流式细胞术检测发现：OXA和5-FU能显著增强HepG2细胞表面HLA-A2分子的表达(P<0.05)。western blot检测显示：OXA和5-FU可以降低HepG2细胞bcl-2的表达,(P<0.05),也可以间接说明细胞的凋亡情况。ELISA检测显示：OXA和5-FU能够降低HepG2细胞分泌免疫抑制性细胞因子IL-10(P<0.001),并且两药联合较之单独作用的OXA或5-FU效果更为明显(P<0.05)。3.基因修饰DC诱导CTL及免疫功能检测AAV/AFP成功转染DC前体细胞(单核细胞),转染效率达91.3%,AFP在DC细胞内表达良好,DC培养良好。AAV/AFP转染DC,能够下调CD14分子的表达水平,明显上调DC共刺激分子CD40、CD80、CD83、CD86的表达水平；可明显上调IL-12的表达水平,下调IL-10的表达水平(P<0.001)。AAV/AFP转染DC激活的T细胞免疫表型中,CD8+、CD8+CD69+、CD8+CD28+T细胞的比例CD8+/CD4+比值均明显增高(P<0.01)；而CD8+CD28-T细胞和(?)CD4+CD25+FoxP3+Treg细胞的比例均显著降低(P<0.05)。CD4+T细胞比例较前略有降低,但差异无统计学意义(P>0.05)。4.化疗联合基因修饰的树突状细胞对靶细胞的体外杀伤效应ELISA检测显示：与对照组相比,OXA和5-FU联合作用的HepG2细胞刺激CTL分泌IFN-γ的水平明显升高,并且高于单独的OXA或5-FU处理的HepG2组(P<0.001)。LDH法检测在CTL对各种靶细胞的杀伤活性可见：基因转染的CTL对AFP阳性的HepG2细胞有明显的杀伤作用(P<0.001),而对AFP阴性的细胞没有明显杀伤作用,并且CTL对靶细胞的杀伤活性具有抗原特异性和MHC限制性。化疗与DC/CTL联合在一定浓度和效靶比时对靶细胞HepG2细胞的杀伤率显著高于二者单独应用对HepG2细胞的杀伤率(P<0.001),化疗联合DC/CTL组(联合组)的杀伤率是化疗组(OXA+5-FU)的2.18倍,是DC/CTL组2.62倍。说明DC对小剂量化疗有协同和增强作用。结论1.在体外实验中,我们证明化疗药物OXA与5-FU在一定剂量范围内能够增强肝癌HepG2细胞表面MHC-I类分子HLA-A2的表达,降低其表面bcl-2的表达,抑制其免疫抑制性细胞因子IL-10的分泌。提示化疗药物OXA与5-FU除了能诱导肿瘤细胞凋亡外,还可以作为免疫调节齐(?)(immune-modulation),调节肿瘤微环境,改变肿瘤细胞的细胞学特征,去除部分免疫抑制因素,从而使其更容易被机体免疫系统识别并杀伤。2.以AAV为载体介导抗原基因转染DC,并诱导靶抗原特异性和MHC限制性的CTL,对抗原阳性的肿瘤细胞具有较高抗肿瘤活性,有望成为肿瘤免疫治疗的理想方法。AFP可能是肝癌免疫治疗的理想靶点。3.采用低剂量化疗去除部分免疫抑制因素,联合应用AAV-抗原基因致敏的树突状细胞疫苗,激发肿瘤抗原特异性免疫,从而杀伤肿瘤细胞,能产生“1+1>2”的协同作用效果。提示适当种类和剂量的化疗药物与基因修饰的树突状细胞疫苗联合应用,有相互协同和增强抗肿瘤效应,本研究结果为肝癌的综合治疗提供新的思路和实验依据。