目的筛选并验证越南参变种不同组织部位适宜的内参基因,为越南参变种中的基因表达相关研究提供参考,同时对越南参变种的鲨烯环氧酶进行功能研究。方法基于前期研究中所获得的越南参变种转录组数据,从中筛选候选内参基因,设计特异性引物,利用qRT-PCR技术检测候选内参基因在越南参变种不同组织部位(根、根茎、茎和叶)的表达水平,并利用geNorm、NormFinder和BestKeeper 3个分析软件综合分析候选内参基因的表达稳定性。在前期的研究基础上,重新设计PvfSE2、PvfSE2~d的特异性引物,与pMal-c2X构建原核表达载体,以His-SmCPR质粒为模板,构建丹参P450还原酶(SmCPR)的原核表达载体pET-28a-SmCPR、pET-28a-SmCPR~d,将重组质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达蛋白,SDS-PAGE电泳检测蛋白表达情况,并利用qRT-PCR技术检测鲨烯环氧酶基因在越南参变种不同组织部位的表达水平。结果1.基于越南参变种转录组数据,总共筛选出13个候选内参基因(ACT1、ACT2、bTUB1、bTUB2、aTUB、GADPH、UBQ、elF、EF-1a、F-box、CYP、QCR、TCTP)。采用qRT-PCR技术检测13个候选内参基因在越南参变种不同组织部位的表达水平,综合3个软件分析结果表明,越南参变种不同组织部位适宜的内参基因为ACT1和aTUB。2.课题组在前期的研究中共克隆得到4个SEs基因,分别命名为PvfSE1、PvfSE2、Pvf SE3、PvfSE4。其中PvfSE1、Pvf SE3和Pvf SE4的截断序列均成功表达,获得相应融合蛋白。在本实验中,我们成功构建PvfSE2截断序列(33~475 aa)、SmCPR、SmCPR截断序列(61~701 aa)的原核表达载体pMal-c2X-Pvf SE2~d和pET-28a-SmCPR、pET-28a-Sm CPR~d。将重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,SDS-PAGE电泳结果显示,PvfSE2~d、SmCPR、SmCPR~d均在上清液中成功表达,获得相应融合蛋白。利用实时荧光定量PCR技术,以ACT1为内参基因检测PvfSEs基因在不同组织部位的表达水平。结果表明:PvfSE1在根中表达量最高,在茎中表达量最低;PvfSE2与Pvf SE3在不同组织部位的表达水平趋势相同,在根茎中的表达量明显高于其他组织部位,根中最低,茎、叶次之;PvfSE4在根中的表达量略高于其他组织部位,其在根、根茎、茎及叶这四个组织部位中表达水平差异明显较另三个SEs基因小。总体来说,Pvf SEs在主要在根及根茎中表达,而在茎和叶表达水平低。结论本研究首次筛选并验证出越南参变种不同组织部位适宜的内参基因为ACT1和aTUB,为后续开展越南参变种的功能基因表达水平的研究奠定了基础。成功构建pMal-c2X-PvfSE2~d、pET-28a-SmCPR、pET-28a-SmCPR~d原核表达载体,并在大肠杆菌中成功表达获得可溶性蛋白,为后续对越南参变种SEs的功能研究及三萜化合物生物合成途径的解析奠定基础。