带状疱疹后神经痛(postherpetic neuralgia; PHN)是带状疱疹后期最常见和最严重的并发症,这种剧烈的神经痛通常在皮疹消退后一个月产生,并且维持三个月以上的时间。PHN是一种慢性神经病理性痛,像其他类型神经病理性痛(外伤,炎症,糖尿病等引起)的疼痛症状和体征,主要表现为受损皮区产生自发痛,异常疼痛和痛觉过敏。PHN通常持续迁延,其发病率与老龄化密切相关,并且临床上证实各种镇痛药(三环类抗抑郁药、抗癫痫药、阿片类药、非甾体类抗炎药等)对于PHN的镇痛效果甚微。PHN可导致失眠、焦虑、抑郁,甚至是生活和工作能力的丧失。PHN严重地影响着带状疱疹病人的预后和生活质量,然而目前针对PHN尚无有效的预防和治疗措施,其主要原因是对于PHN的发病机制未能明确阐述。传统观点认为,周围神经纤维和末梢的炎症和变性是PHN发病的主要原因。然而越来越多的学者认为,PHN的形成并不只是由周围神经的病变所致,PHN的形成可能与中枢神经系统(脊髓和大脑)病变有着密切关系。传统观念认为疼痛发生和疼痛调控只有神经元及其纤维发挥作用,然而近来上述观点已发生明显变化,中枢神经系统胶质细胞(星形胶质细胞和小胶质细胞)的激活对于神经病理性痛的诱导和维持同样至关重要。在外伤或炎症引起的神经病理性痛模型上,脊髓背角星形胶质细胞或小胶质细胞都有不同程度的激活,激活的胶质细胞会释放大量的各种活性分子(包括神经营养因子、促炎性细胞因子和化学物质等)。这些活性分子可能会作用于神经突触终末和神经元胞体上相应的自身受体,从而增强突触信号传递,最终导致疼痛信号过度的放大以及痛觉过敏的形成。目前,在带状疱疹后神经痛(PHN)病理生理机制方面的研究,并没有中枢胶质细胞方面的报道。由于①PHN本身就是一种神经病理性痛,②PHN的形成与中枢神经系统的病变有着密切关系,③中枢胶质细胞激活导致病理性痛是近年研究的热点;本课题预测脊髓中枢胶质细胞的激活和活性分子的过多释放极有可能参与了带状疱疹后神经痛的产生和维持。基于此本课题以PHN大鼠模型为工具,综合运用行为学、形态学、分子生物学和电生理学等神经科学研究方法,进行了开拓性实验。本课题研究结果如下:①将水痘-带状疱疹病毒(varicella-zoster virus; VZV)注入SD大鼠的足底,形成了显著的机械性痛觉过敏(von Frey丝检测),而假接种组(Mock infected)和空白对照组(Naive)没有出现机械性痛觉过敏;对VZV注射组系统给予抗病毒治疗,结果对机械性痛觉过敏并没有任何影响。以上结果提示VZV感染导致了PHN,并且PHN并非由病毒的急性活跃性复制引起。②星形胶质细胞的特异标记物为胶质原纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein; GFAP),而小胶质细胞的特异标记物为白细胞分化抗原11b(CD11b; OX-42)。免疫荧光组织化学染色显示,与对照组相比,在水痘-带状疱疹病毒(VZV)引起的带状疱疹后神经痛(PHN)大鼠模型,脊髓背角GFAP的染色密度出现了显著增加,并且增加的染色密度主要集中在脊髓背角浅层。Western blot检测显示,PHN大鼠模型脊髓背角GFAP的蛋白表达水平具有显著提升,并且GFAP的表达水平与痛觉阈值的降低密切相关。荧光实时定量PCR检测显示,PHN大鼠模型脊髓背角GFAP的mRNA核酸表达水平同样具有显著提升。另外,在所有大鼠,脊髓背角OX42的表达没有任何变化。以上结果提示在PHN时,脊髓背角星形胶质细胞而不是小胶质细胞处于激活状态,并且有可能对于痛觉信息的调控至关重要。③在PHN大鼠模型痛觉的形成期和维持期,经鞘内给予星形胶质细胞抑制剂LAA (L-α-aminoadipate)能够剂量依赖地产生镇痛作用,而小胶质细胞抑制剂Minocycline对于痛觉阈值没有任何影响。将LAA与三环类抗抑郁药,抗癫痫药,吗啡等传统镇痛药相结合,结果对于PHN产生明显的协同镇痛作用。以上结果提示脊髓星形胶质细胞而非小胶质细胞的激活诱导和维持了PHN,LAA与传统镇痛药相结合使用,可以减少用药量,提高药效,减低副作用。④细胞外单电位电生理检测显示,与对照组相比,在PHN大鼠模型,脊髓背角广动力阈神经元出现了显著的放电频率增加,即疼痛的中枢敏化。在PHN大鼠模型,经鞘内给予星形胶质细胞抑制剂LAA (L-α-aminoadipate)能够明显抑制放电频率的增加,而小胶质细胞抑制剂Minocycline对于放电频率没有任何影响。以上结果提示PHN状态下脊髓星形胶质细胞的激活导致了脊髓背角神经元的中枢敏化。⑤与对照组相比,在PHN大鼠模型,背根神经节和脊髓背角诱生型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase; iNOS)的表达出现了显著上调,并且鞘内给予L-NIL (iNOS抑制剂)或者PTIO (NO清除剂)均能抑制GFAP的表达上调。以上结果提示PHN状态下脊髓背角iNOS的激活以及NO的过多生成导致了星形胶质细胞的激活。⑥Western blot检测显示,与对照组相比,PHN大鼠模型脊髓背角一些细胞因子,如白介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α);磷酸化MAPK类分子,如磷酸化p38(p-p38)和磷酸化Jun氨基末端激酶(p-JNK)都有显著的表达上调。在PHN大鼠模型,经鞘内给予细胞因子清除剂pentoxifylline或者白介素-1受体拮抗剂(IL-1ra)均能产生明显的镇痛作用。在PHN大鼠模型,脊髓背角IL-1β的蛋白表达变化与GFAP的蛋白表达变化过程相一致;免疫荧光双重标记显示,IL-1β免疫阳性产物只是定位于GFAP阳性细胞而非NeuN或OX42阳性细胞。在PHN大鼠模型,经鞘内给予星形胶质细胞抑制剂LAA能够明显降低IL-1β的过度表达。以上结果提示PHN状态下脊髓星形胶质细胞过多生成释放IL-1β,IL-1β导致了痛觉过敏的产生。⑦Western blot检测显示,与对照组相比,PHN大鼠模型脊髓背角磷酸化的NMDA受体NR1亚单位(P-NR1)的表达水平具有显著提升。在PHN大鼠模型,经鞘内给予NMDA受体拮抗剂AP5或者MK-801均能产生明显的镇痛作用。在PHN大鼠模型,脊髓背角P-NR1的表达变化与IL-1β或GFAP的蛋白表达变化过程相一致;免疫荧光双重标记显示,P-NR1免疫阳性产物和IL-1RI免疫阳性产物只是定位于NeuN阳性细胞而非GFAP或OX42阳性细胞,并且P-NR1免疫阳性产物和IL-1RI免疫阳性产物互相之间完全双标。在PHN大鼠模型,经鞘内给予星形胶质细胞抑制剂LAA,细胞因子清除剂pentoxifylline或者IL-1受体拮抗剂IL-1ra均能明显降低P-NR1的过度表达。以上结果提示过多生成的IL-1β作用于神经元上自身受体IL-1RI促进了NMDA受体NR1亚单位的磷酸化,最终导致了痛觉过敏和中枢敏化。⑧脊髓背角膜片钳全细胞记录显示,在PHN痛觉过敏状态下,星形胶质细胞过多生成的IL-1β作用于突触前末梢上自身受体,从而促进了谷氨酸的释放。另外,IL-1β作用于突触后胞体上的自身受体,从而增强了谷氨酸的突触后兴奋性效应。以上结果提示IL-1β作用于神经元突触前或突触后能够引起兴奋性效应。综合以上所有研究结果,本人得出的最终结论是:在PHN时,脊髓背角激活的星形胶质细胞过度生成和释放IL-1β。一方面,IL-1β作用于突触前末梢上自身受体IL-1RI从而触发了致痛物质谷氨酸的过多释放;另一方面, IL-1β作用于突触后神经元上自身受体IL-1RI,从而激发胞内信号转导和NMDA受体NR1亚单位的磷酸化,NR1亚单位的磷酸化会致使NMDA受体的分子构象发生变化,使NMDA受体对于其配体谷氨酸的反应性增强,进一步使突触后神经元细胞膜的去极化更明显。以上IL-1β突触前和突触后的综合效应就是:最终导致动作电位过多的产生和痛觉信号过度的放大,引发中枢敏化和痛觉过敏。本课题首次提出脊髓星形胶质细胞的激活导致了PHN的产生和维持,深入探讨了PHN时星形胶质细胞合成释放的活性分子IL-1β导致脊髓背角神经元中枢敏化的具体分子机制,为更深入地认识PHN的发病机制开辟了新途径,为PHN的预防治疗提供了一个新的靶点。