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SCYL1-BP1是本实验室通过酵母双杂交技术,首先从人胎盘cDNA文库中克隆得到的一个能与SCYL1相互作用的新基因。前期的研究结果发现,该蛋白主要分布在核内,少量分布于核周和胞浆中。该基因转染细胞后能显著抑制肝癌细胞株的生长与集落形成,同时具有显著抑制荷瘤裸鼠的肿瘤形成的作用。该基因过表达时会延长细胞在G2-M期的停留时间,抑制细胞生长。该基因过表达能稳定P53蛋白免于被MDM2介导的泛素化途径降解。基因表达谱芯片检测发现当该基因被RNAi抑制时,可以引起NFκB的表达上调。相关文献报道表明,NFκB的过度激活可以引发肿瘤。结果提示,SCYL1-BP1基因具有细胞周期调控功能,并具有肿瘤抑制因子的特性。为了获得足够量的纯化SCYL1-BP1蛋白以便用于进行新药安全性检测和一系列药理学实验,我们拟采用基因工程技术将该蛋白大量表达。为此本论文分为两个部分,第一部分是关于SCYL1-BP1以大肠杆菌为宿主的原核工程菌株构建及后期蛋白鉴定纯化,第二部分是关于SCYL1-BP1在真核毕赤酵母中的克隆构建以及后期的蛋白分离鉴定。在论文的第一部分中,我们首先将SCYL1-BP1基因克隆到高效表达载体pET-28b-sumo上,构建了原核表达重组载体pET-28b-sumo-SCYL1BP1,后转入大肠杆菌表达宿主菌中,构建了原核表达系统。为了使得重组蛋白SCYL1-BP1大量表达,我们摸索了宿主菌种的选择、IPTG诱导浓度、诱导培养时间、接种量等条件的选择。以期获得重组蛋白的大量表达。但经过培养条件以及诱导条件的摸索,结果发现重组蛋白SCYL1-BP1在大肠杆菌这一原核表达系统中表达效果欠佳,并不能达到预期大量表达的效果。为此,我们进行了重组蛋白SCYL1-BP1的真核表达系统的构建。在论文的第二部分中,我们根据SCYL1-BP1蛋白的氨基酸序列,同时考虑到毕赤酵母的密码子偏爱性,设计引物,通过重叠PCR的方法,合成了适合在毕赤酵母中表达的全长SCYL1-BP1基因序列,并将其克隆到毕赤酵母表达载体pHBM905A上,转化毕赤酵母GS115菌株,从而构建了重组蛋白SCYL1-BP1毕赤酵母真核表达系统。重组毕赤酵母菌株在BMGY中28℃,250rpm培养48h后,转接进入BMMY培养基中,进行26℃,250rpm培养,期间每隔24h向其中加入1%甲醇。培养。SDS-PAGE结果显示50-60kDa区间有特异性条带,初步表明外源蛋白在毕赤酵母中成功表达。