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松褐天牛Monochamus alternatus Hope是松材线虫病的主要传播媒介,控制松褐天牛是有效治理松材线虫病的方法。气味结合蛋白(OBPs)是气味分子与气味受体之间的媒介,在昆虫识别信息化学物质的过程中起着重要的作用,但松褐天牛气味结合蛋白的具体功能仍不明确。为明确Malt OBPs在松褐天牛嗅觉感受中的功能及筛选松褐天牛行为活性物质提供基础,我们构建了松褐天牛触角转录组,筛选并克隆5个Malt OBPs基因,分析了5个Malt OBPs基因的时空表达与行为的相关性,测定了重组Malt OBPs与18种寄主植物挥发物的荧光结合特性及与p H值的相关性。主要取得如下研究结果:1.松褐天牛触角转录组的构建选取松褐天牛雌雄虫成虫触角构建了松褐天牛触角转录组。经过测序、原始序列处理、聚类和拼接共获得85,869条contigs序列,平均长度为297bp;获得37,242条unigenes序列,平均长度为669bp。NR注释的结果表明,94.3%的unigenes与赤拟谷盗Tribolium castaneum(Herbst)和中欧山松大小蠹Dendroctonus ponderosae Hopkins的unigenes相似性最高。对unigenes按照COG功能注释,可分为25个功能群,其中一般功能预测类,复制、重组和修复类包含的unigenes个数最多,分别为3,051条和1,349条。对松褐天牛触角转录组信息进一步筛选比对,共获得OBPs基因全长序列25条,片段序列4条;化学感受蛋白(CSPs)全长序列8条,片段序列4条;气味受体(ORs)全长序列1条,片段序列8条;1条感觉神经元膜蛋白(SNMPs)全长序列。2.松褐天牛Malt OBPs基因的克隆及序列分析通过RT-PCR技术成功克隆了松褐天牛Malt OBP9、Malt OBP10、Malt OBP19、Malt OBP21、Malt OBP24基因(Gen Bank登录号分别为:KF977562、KF977563、KF977572、KF977574、KF977577),开放阅读框分别为423、435、615、390、510bp,各编码140、144、204、129、169个氨基酸,分别有19、25、18、18、0个氨基酸残基的信号肽;其中Malt OBP9和Malt OBP21属于Minus-C OBPs,Malt OBP10属于Classic OBPs,Malt OBP19和Malt OBP24属于Plus-C OBPs;系统进化树表明,Classic OBPs家族、Minus-C OBPs家族和Plus-C OBPs家族分枝明显。3.松褐天牛Malt OBPs基因的时空表达谱通过q PCR检测松褐天牛5个Malt OBPs基因的时空表达情况。结果表明,这5个Malt OBPs基因在雌雄虫下唇须和下颚须的表达量普遍较高,在触角、头、足、腹和翅也有一定的表达;且这5个Malt OBPs基因在触角中的表达量因成虫龄期、性别和交配状态的不同而呈现差异。4.松褐天牛Malt OBPs的原核表达、纯化及结合特性成功构建了重组质粒p ET20b-Malt OBP9、p ET20b-Malt OBP10、p ET20bMalt OBP19、p ET17b-Malt OBP24、p GEX-6P-1-Malt OBP21。p GEX-6P-1-Malt OBP21在上清中表达,通过GST 4B亲和层析柱和Precission protease酶切获得Malt OBP21纯蛋白;p ET20b-Malt OBP9、p ET20b-Malt OBP10、p ET20b-Malt OBP19、p ET17bMalt OBP24主要在包涵体中表达,经过包涵体变复性、DE52弱阴离子交换柱及QFF强阴离子交换层析柱获得纯蛋白。选择1-NPN为荧光探针,利用荧光竞争结合实验测定这5个Malt OBPs在中性和酸性p H环境下与18种寄主植物挥发物单体的结合特性,它们在中性p H环境下与挥发物的结合能力普遍高于酸性p H环境。在中性条件下,2个属于Minus-C OBPs家族的Malt OBPs对其中4种挥发物都表现出较强的结合能力;2个属于Plus-C OBPs家族的Malt OBPs结合特性方面表现比较大的差异,其中一个Malt OBPs对17种挥发物均表现出强结合力,而另一个Malt OBPs仅对5种挥发物表现强结合力。属于Minus-C OBPs,Classic OBPs,Plus-C OBPs家族的5个Malt OBPs结合特性之间并未表现出明显的特征。本研究为明确松褐天牛气味结合蛋白的功能,研制行为调节剂以及明确气味结合蛋白在昆虫体内的功能奠定了重要基础。