随着生物技术的发展,利用酶法解决农业废弃物问题已成为研究热点之一。内切β-1,4-葡聚糖酶(endo-β-1,4-glucanse,EC 3.2.1.4,简称EG)属于糖基水解酶类,作用于β-1,4-葡聚糖苷键,在纤维素降解过程中起着至关重要的作用。目前已有不少EG被成功表达,但仍存在酶活力低、酶学性质无法满足工业需求等问题。糖苷水解酶8家族(GH8)内切葡聚糖酶具有广泛的底物特异性,在各种工业应用中都极具吸引力。为此,本研究以来源于吡咯伯克霍尔德氏菌(Burkholderia pyrrocinia)的GH8内切β-1,4-葡聚糖酶为研究对象,在大肠杆菌BL21中进行可溶性表达,并对其酶学性质进行较系统的研究,主要结论如下:(1)以吡咯伯克霍尔德氏菌基因组为模板扩增得到编码内切β-1,4-葡聚糖酶的基因Bp EG01790。该基因片段开放阅读框(ORF)为1218 bp(G+C含量为50%),编码406个氨基酸(AA)残基,其中前40位为信号肽,其预测分子量和p I分别为43.0 k Da和9.50。Bp EG01790与GH8的酶具有90%以上的相似性,与来源于吡咯伯克霍尔德氏菌的GH8纤维素酶的同源性最高为98.28%。同时,多序列比对结果显示氨基酸残基E84和D145为催化中心,与GH8酶高度保守的催化活性位点一致。(2)将该基因克隆到p ET-28(+)表达载体,结果显示未实现可溶性表达。更换p Cold TF表达载体后成功实现了可溶性表达,且切除信号肽后的重组工程菌株产酶水平更高。(3)利用Plackett-Burman设计结合响应面法优化了产酶条件,产酶水平由3.1 U/m L提高到39.9 U/m L。确定最终产酶条件:初始p H5.9、诱导时机10 h、诱导时间12 h、IPTG终浓度为0.12 m M、摇床转速为200 rpm、诱导温度为20℃、接种量为1%。(4)利用亲和层析和离子交换层析完成了EG的纯化。酶学性质研究结果显示EG的最优p H为6.0,在p H6.0-8.0范围内残余酶活保持在90%以上,处于相对稳定状态。最优温度为40-45℃,该酶在10℃表现出30%左右的活性(相对于最高酶活)。当温度超过25℃残余酶活急剧下降,属于冷适应性酶。EG具有严格的底物特异性,可将葡聚糖降解为低聚寡糖,在葡寡糖的生产中具有良好的应用前景。本研究实现了源于吡咯伯克霍尔德氏菌GH8内切β-1,4-葡聚糖酶在原核体系中的可溶性表达,进一步扩充了GH8 EG家族,较系统的考察了其酶学特性,为工用酶提供了更多的选择。同时,利用生物酶法处理农业废弃物,高效环保且提高附加值和利用率,解决了环境问题。