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临床上，供体器官的严重短缺，使人们将目光转向了异种移植。到目前为止，猪被认为是最适合的异种移植供体。但研究发现，以前病毒DNA形式整合进猪体细胞基因组中的猪内源性反转录病毒(porcine endogenous retrovirus，PERV)在体外能够感染多种人源细胞，这引起了人们对异种移植安全性的广泛关注。我国有着丰富的小型猪种资源，目前已经开展猪-人异种器官／组织移植的相关研究，但有关小型猪中PERV的携带、表达情况以及内源性释放毒株的生物学特性方面报道甚少，因此有必要开展这方面的研究工作，了解我国小型猪中PERV存在的本底，为异种器官受体提供安全可靠的器官，同时通过分析PERV 5’非编码区的启动子活性，为进一步研究PERV的生物学特性搭建技术平台。另外，由于传统的逆转录病毒载体在介导基因转移的过程中存在着包装病毒的滴度较低以及某些病原的安全问题，而基于PERV的长末端重复序列构建的逆转录病毒载体则有可能解决这些问题，因为PERV是猪在进化过程中获得的反转录病毒序列，每个细胞中PERV的拷贝数约为8-15个，尚未发现其致病性，并且由于在猪源细胞中有同源序列的存在，转染载体至猪源细胞有可能获得较高的包装病毒滴度。目前国际上对PERV的研究均着眼于异种移植中其病原安全性的评价等方面，至今尚未见有利用其作为逆转录病毒载体的报道，因而，本研究也构建了以PERV长末端重复序列为调控序列的逆转录病毒载体。本研究主要进行以下三个方面的工作：
1．中国五指山猪中PERV存在与表达情况的调查
检测分析猪内源性反转录病毒(porcine endogenous retrovirus；PERV)在中国五指山猪中的携带、表达情况。首先根据军事医学科学院野战输血研究所己建立的PCR、RT-PCR方法，应用通用的env基因分型方法检测PERV env-A、env-B、env-C在我国主要小型猪种之一的五指山猪基因组中的存在与表达情况。随后又对五指山猪中PERV核心蛋白基因(gag)、多聚酶基因(pol)及囊膜基因(env)的存在与表达进行检测。结果发现：从病毒存在的情况看，我国五指山猪基因组中普遍存在PERV，其阳性100％。PERV的存在以A亚型最高(97.01％)，其次为B亚型(94.03％)，此次未检测到C亚型的存在；从病毒的表达情况看，PERV-B亚型的表达率高于A亚型，但所有的样品均未检测到PERV-C型的表达。从病毒主要结构蛋白的存在与表达情况看，五指山猪基因组中不仅存在PERVgag、pol、env特异性DNA，而且都能够转录为RNA。由此说明我国五指山猪外周血淋巴细胞基因组中存在PERV-A、B 2种亚型，并且A、B两种亚型均能够表达。
2．对PERV 5’非编码区启动子活性的分析
将缺失不同功能区的猪内源性反转录病毒(PERV)5’非编码区(5UTR)克隆至萤光素酶表达载体上，转染瞬时表达细胞COS-7，检测萤光素酶的表达，分析5UTR的转录调控规律。结果表明：缺失R区的5’UTR显示出很强的启动子活性，U3重复区序列缺失的5’UTR启动子活性显著下降。UTR显示出较之LTR强的启动子活性。缺失整个U3区的UTR比仅缺失U3重复区的UTR启动子活性强。由结果分析得出以下结论：在R区有转录因子的结合位点可引起转录活性下降；U3重复区序列表现出增强子的活性。在5’UTR的下游序列中，包括引物结合区(PBS)和前导序列(Leader)可能有某些转录因子的结合位点可引起转录增强，同时在U3重复区的上游和下游序列可能存在某些转录因子的结合位点可降低5’UTR的转录活性。
3．基于PERV长末端重复序列的逆转录病毒载体的构建
采用PCR和酶切的方法以猪内源性反转录病毒(PERV)的长末端重复序列(LTR)替换逆转录病毒载体pMIGRl的转录调控序列，构建了以猪内源性反转录病毒的LTR为调控序列的逆转录病毒载体pMP，并对此载体携带外源基因的能力及表达水平进行了评价。结果表明：pMP在哺乳动物细胞PK-15中能够表达其所携带的外源基因neo，且表达水平略高于其原始载体pMIGRl。Southern blotting结果表明pMP载体具有稳定整合外源基因至PK-15基因组中的能力。由于pMP载体的构建是整个PERV逆转录病毒载体系统构建的部分工作，因此本研究也尝试对pMP的被包装能力作出相关评价。将在pMP多克隆位点处插入neo基因的pMPN和pMIGRl-5’UTR分别与pMIGRl的包装系统pGAG-POL及pVSV-G共转染HEK293-T细胞，结果表明细胞上清均未表现出感染性；转染pMPN至PK-15细胞，其细胞上清检测结果也为阴性。这些结果提示：异源的转录调控序列与结构蛋白包装质粒可能无法结合在一起，而有必要构建与其逆转录病毒载体同源的结构蛋白包装质粒，即能在真核细胞中高效表达293-WZS-PERV的gag、poI的真核表达质粒来完成pMP的正确包装。