研究背景：老年痴呆（Senile dementia）是一种易发生在高龄人群的以逐渐加重的进性认知功能障碍为主要表现的神经系统退行性疾病。我国已成为全世界老年人数量最大的国家，统计显示我国老年人群中老年痴呆的平均患病率为3.7%～7.8%，我国老年痴呆的患病人数已超过五百万。老年痴呆严重影响患者生活质量，并威胁到患者生命，给家庭、社会造成巨大的人力及经济负担，由于缺乏有效的治疗手段，该疾病已成为危害人类健康的主要致死性疾病之一，目前已经成为备受社会关注的社会热点问题之一。老年痴呆有多重致病原因，其中血管性痴呆（vasculardementia，VD）是其最常见的形式之一，约占其发病总数的20-30%。其主要发病机制是各种原因导致的脑供血不足导致中枢神经系统功能逐渐减退，进而出现进行性加重的认知功能障碍。多年来广大科研工作者长期致力于该疾病的机制及防治研究，世界卫生组织已将此血管性痴呆列为21世纪的重点研究项目，虽取得了较大进展，但目前仍无有效防治该疾病的药物或措施。人参是一种具有悠久历史的传统中药，已有上千年药用历史，已被以单独或作为一种成分广泛应用于临床，具有抗自由基、抗凋亡、改善微循环等多种功效，已被运用于心肌梗死、中风等多种疾病的治疗，并取得了肯定疗效。人参皂甙（Gnsenoside，GS）是人参主要药理活性成分，Rb1是人参二醇组皂甙。在人参的众多皂甙成分中以Rb₁含量高，活性强，具有人参的大部分药理作用。前人的研究结果提示人参皂甙可减轻颞叶癫痫所致的大鼠认知功能障，但人参皂甙Rb₁对血管性痴呆所致的认知功能障碍是否有治疗作用尚不明确。故本实验拟利用双侧颈总动脉永久结扎大鼠模型复制大鼠血管性痴呆模型，运用行为学、膜片钳技术、分子生物学等多种技术研究人参皂甙Rb₁对大鼠血管性痴呆是否有治疗作用。实验目的：1．证实人参皂甙Rb₁对VD大鼠的治疗作用；2．初步探索人参皂甙Rb₁防治VD的机制。实验方法：1．实验动物、分组及模型复制雄性健康SD大鼠60只，体质量200～250g，将动物随机分为三组。对照组（Control group）、模型组（Model group）、人参皂甙Rb₁治疗组（Ginsenoside Rb1group）。Ginsenoside Rb1group大鼠进行双侧颈总动脉结扎（2-VO），结扎后给予人参皂甙Rb₁，腹腔注射，2mg/kg·d，1次/日，模型组进行双侧颈总动脉结扎后每日给予等量生理盐水腹腔注射，对照组手术过程同前，但不结扎颈总动脉，术后给予等量生理盐水。术后28天，先进行Morris水迷宫行为训练及测试，然后麻醉后断头处死并取海马组织，检测相应指标。2．Morris水迷宫行为测试术后28天进行Morris水迷宫训练，共5天，每天训练2次，具体训练方法为：分别从4个不同象限的中点将大鼠头朝池壁放入水池，任其在水中自由游泳，如大鼠在60s内找到并爬上平台，让其在平台上停留30s，以强化记忆效果，逃避潜伏期为实际寻找平台所用的时间，如在60s内大鼠未能找到平台，则由实验者用工具将其引导至平台，同样让大鼠在平台上停留30s，以强化记忆效果，同时以60s为逃避潜伏期。上述运动轨迹被设在水池正上方的摄像记录系统实时记录。取每天训练所记逃避潜伏期的平均值作为当日的逃避潜伏期。②空间探索试验：在开始训练前和训练5天结束后进行实验，具体方法为：撤除平台，从原平台所在象限对侧象限的中点面朝池壁放入大鼠，任其在水中自由游泳120s，用设在水池正上方的摄像记录系统实时记录大鼠运动轨迹，并计算大鼠在平台所在象限活动的时间。3．海马脑片制备异氟烷吸入麻醉后断头处死大鼠，低温条件下快速取脑，然后将其浸入冰浴人工脑脊液中，该脑脊液已被预充氧气、二氧化碳混合气（O295%、CO25%）达饱和状态，其主要成份为（mmol/L）：glucose （11），NaCl （126），CaCl2（2.4），MgCl2（1.2），NaH2PO4（1.2），KCl （2.5），NaHCO3（26）（用NaOH滴定pH至7.35-7.45）。持续供氧并冰浴条件下，利用震动切片机将鼠脑切为厚度400μm的脑片，取海马位置佳的脑片置于预充氧气、二氧化碳混合气的人工脑脊液中，34℃恒温条件下孵育1h，以恢复脑片活性。孵育后，小心将脑片移至记录浴槽，浴槽中持续灌流氧饱和的人工脑脊液（2ml/min），以维持脑片活性。4．海马CA1区长时程增强（LTP）记录记录电极内液为NaCl溶液（3mol/L），外液为人工脑脊液。测试脉冲参数：波形为方波，频率0.05Hz，波宽100μs，刺激强度以能诱发50%最大兴奋性突出后电位（fEPSP）为准。高频强直刺激（HFS）参数为：强度、波宽同测试脉冲，频率100Hz，时程1s。记录位点：利用倒置显微镜，将电极间距约300μm的激电极置于海马Schaffer侧支纤维处，将记录用玻璃微电极置于海马CA1锥体细胞层。测试步骤：给予适当强度的测试脉冲，开始记录fEPSP，待记录基线平稳后，继续记录fEPSP30分钟以上，给予间隔20s的两次HFS刺激，然后继续给予测试脉冲并记录fEPSP，持续1h以上。将刺激后的fEPSP斜率标准化为刺激前fEPSP斜率的百分比，该数值可作为评价fEPSP强度的定量客观指标。5．海马组织中Bcl-2、Bax及活化的caspase-3表达水平的检测实验结束后，断头取脑，取海马组织，制成匀浆，3000r／min离心20分钟（4℃）后，取上清，改良Lowry法测定蛋白浓度，-70℃保存备用。取总蛋白量一致的各样品，加入1μL的β-巯基乙醇及一定体积的1×SDS加样缓冲液，混匀，煮沸10分钟后，4℃条件下离心5分钟（10000r／min），加样，聚丙烯酰胺凝胶电泳电泳分离蛋白，半干式电转印至聚偏二氟乙烯膜上。将聚偏二氟乙烯膜置于5％牛奶封闭液中，室温2h。加一抗（Bcl-2抗体，1:400；Bax抗体，1:1000；活化的caspase-3抗体，1:500），4℃过夜。氨基丁三醇缓冲液漂洗3次，每次10分钟。加二抗（羊抗兔IgG），室温孵育2h后，用氨基丁三醇缓冲液漂洗3次，每次l0分钟。增强化学发光法显色，扫描拍照。6．氧化应激相关指标的检测取左侧海马组织在电子天平上称重，匀浆，在4℃低温离心机中4000r/min离心10分钟，取上清液，按照试剂盒说明书测定脑中超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）、谷胱甘肽（GSH）、丙二醇（MDA）。7．统计学分析实验所得数据结果以x±ｓ表示，用spss13.0进行统计学分析，fEPSP斜率和寻找平台潜伏期的组间比较采用重复测量的多因素方差分析及Tukey-Kramer检验，其余数据均用单因素方差分析进行统计学分析。以P <0.05为有统计学意义。实验结果：1人参皂甙Rb1可显著减轻慢性缺血对大鼠寻找平台潜伏期的影响在Morris水迷宫实验中模型组大鼠寻找平台的潜伏期明显长于健康对照组，有显著统计学差异（P <0.05），人参皂甙Rb1治疗后大鼠寻找平台潜伏期较模型组显著缩短（P <0.05）（Fig1），提示人参皂甙Rb1可显著减轻慢性缺血导致的大鼠寻找平台潜伏期延长，减轻慢性缺血对大鼠记忆力的损害。2人参皂甙Rb1可明显延长VD大鼠在目标象限的停留时间如Fig2所示，空间探索试验中，模型组大鼠在目标象限的停留时间显著短于对照组（P <0.05），人参皂甙Rb1治疗组大鼠在目标象限的停留时间较模型组明显延长（P <0.05），人参皂甙Rb1可显著延长慢性缺血大鼠在目标象限的停留时间，再次证实人参皂甙Rb1可减轻慢性缺血对大鼠记忆力的损害。3人参皂甙Rb1可显著减轻慢性缺血导致的大鼠海马LTP抑制电生理实验证实，给予HFS后各组大鼠海马fEPSP均较前增强，即各组均可诱发LTP，并持续1小时以上。与对照组相比HFS刺激后模型组LTP被显著抑制（P<0.05），人参皂甙Rb1治疗可显著减轻慢性缺血导致的大鼠海马LTP抑制，人参皂甙Rb1治疗组LTP较模型组显著增强（P<0.05），从脑片电生理水平再次证实人参皂甙Rb1可减轻慢性缺血对大鼠记忆力的损害（Fig3）。4人参皂甙Rb1对VD大鼠海马Active-caspase-3水平的影响Western blot结果显示，模型组海马组织的Active-caspase-3表达水平较正常对照组明显升高，人参皂甙Rb1治疗后海马Active-caspase-3表达水平显著下降。提示：人参皂甙Rb1可以显著减轻VD大鼠海马组织的Active-caspase-3水平升高，提示其可抑制海马细胞的凋亡（Fig4）。5人参皂甙Rb1对VD大鼠海马bax/bcl-2表达水平的影响如图5A所示，模型组海马bax蛋白表达水平较正常对照组显著升高，bcl-2蛋白表达水平较正常对照组明显下降，人参皂甙Rb1治疗后bax蛋白表达水平显著下降，bcl-2表达水平显著升高。利用Biosens凝胶分析系统进行图像分析，计算bax/bcl-2灰度比值，结果示：与对照组相比，模型组海马bax/bcl-2比值明显升高（P <0.05），人参皂甙Rb1治疗组bax/bcl-2比值较模型组下降（P <0.05）（图5B）。上述结果证实：人参皂甙Rb1可以显著减轻VD大鼠海马细胞的凋亡。.6人参皂甙Rb1对VD大鼠海马氧化应激水平的影响由tab1可见，模型组大鼠脑组织SOD、GSH-Px、GSH均较正常对照组显著降低（P<0.05），MDA较正常对照组明显增高（P<0.05），人参皂甙Rb1治疗后可显著提高VD大鼠海马组织SOD、GSH-Px及GSH的水平（P<0.05），并降低海马组织MDA水平（P<0.05）。上述结果提示：人参皂甙Rb1可显著减轻VD大鼠氧化应激反应水平。结论：1．本课题从动物行为学及脑片电生理两个不同水平证实人参皂甙Rb₁对VD大鼠认知功能障碍的治疗作用。2．人参皂甙Rb₁对VD大鼠认知功能障碍的治疗作用可能和其轻海马神经元的凋亡有关。3．人参皂甙Rb₁对VD大鼠认知功能障碍的治疗作用可能和其降低海马氧化应激水平有关。