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[目的]采用环介导恒温扩增和解螺旋酶依赖的恒温扩增方法建立丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)基因分型的方法。[方法]1.建立HCV的恒温扩增反应体系。基于环介导恒温扩增(LAMP)的原理,针对丙型肝炎病毒HCV-1b,2a,3和6a基因型设计每种亚型的引物。基于解螺旋酶恒温扩增(HDA)的原理,设计一对通用引物以扩增HCV-1b,3a和3b,另设计一对通用引物扩增HCV-2a和6a,在两个体系中分别设计各亚型的探针对HCV进行基因分型。2.依据HCV全基因的5,UTR～Core区中各基因型特异的基因序列,用Primer Explorer V.4软件设计1 b,2a,3和6a型对应的引物用于LAMP扩增,优化LAMP反应体系。设计HCV-1/3引物和2/6引物用于HDA扩增,每个体系设计对应型别Taqman探针用于基因分型。3.LAMP法扩增HCV的性能评价。将所设计的引物与对应的模板反应,确定所设计的HCV各基因型的引物特异性。对不同型别的阳性标本倍比稀释,稀释后的不同浓度的样本平均分成10份分别提取RNA,加入对应的特异性的引物,以10个样本全部检测为阳性的最低浓度确立为该方法的最低检测限。以HIV,HBV,HAV阳性血清提取的核酸作为模板与所设计的LAMP引物进行反应,验证这两种方法的抗干扰能力。4.LAMP法对HCV基因分型的临床应用。80例临床筛选丙肝阳性的血清经过测序确认基因型后,HCV-1b,2a,3和6a型各选取20例,同时用LAMP法和实时荧光定量PCR同时进行检测,比较两者之间的检出率和正确性。5.以HDA扩增反应的引物采用常规PCR试剂验证引物的可行性,再采用HDA试剂进行检测,并依据对LAMP方法进行性能评价的方案对HDA法进行方法学分析性能评价。[结果]1.成功建立了 HCV基因分型的LAMP检测方法。LAMP在65℃,60min下可以用肉眼可见的方式区分HCV-1b,2a,3和6a四种基因亚型。2.基于LAMP方法原理建立的HCV基因分型方法的引物只与对应模板反应,与其他病毒模板无交叉反应。检测HCV-1b,3和6a型的最低检测限为1.5×103IU/mL.,HCV-2b 的最低检测限为 1.0×103 IU/mL。3.LAMP法与PCR法的临床比较。对80份临床标本进行测序确定HCV基因型检测(HCV-1b,2a,3,6a各20份),用LAMP法成功检测75份为阳性,其中1b,2a,3,6a分别为20,17,18,20份,用rea1-time PCR方法检测74份为阳性,其中1b,2a,3,6a分别为20,18,19,17份。检测时间进行比较LAMP方法用时60min,real-time PCR 法用时 90min。4.基于HDA法原理设计的HCV-1/3通用引物能,采用常规PCR方法可正确扩增出HCV-1b,3a和3b基因亚型,但采用HDA方法尚未获得成功。[结论]本研究所建立的LAMP检测方法能够特异,敏感地检测出HCV-1b,2a,3和6a四种基因亚型。设计用于HDA的HCV1/3型通用引物采用常规PCR方法能得到正确的产物,但采用HDA扩增方法尚未成功。