鸡的心包积液综合征(hydropericardium hepatitis syndrome,HHS)和包涵体肝炎(inclusion body hepatitis,IBH)均是由禽Ⅰ群腺病毒引起的急性传染病。近年来,这两种疾病在我国的发病率呈上升趋势,给养鸡业造成很大的经济损失。禽Ⅰ群腺病毒分为A、B、C、D、E等5个基因型,按照血清型分为1、2、3、4、5、6、7、8a、8b、9、10、11型;基因型和血清型的对应关系为A(1)、B(5)、C(4、10)、D(2、3、9、11)、E(6、7、8a、8b)。当前我国HHS和IBH的主要病原分别是禽Ⅰ群腺病毒血清4型(FAdV-4)和血清8b型(FAdV-8b)。因此,研制FAdV-4和FAdV-8b二价油乳剂灭活疫苗具有重要的应用价值。1 FAdV-8b QD2016株的分离与鉴定本研究从山东某鸡场疑似发生IBH的病例中分离到1株禽腺病毒(命名为QD2016株)。设计了 33对引物,对QD2016株全基因组序列进行扩增、测定和生物信息学分析。(QD2016株基因组全长为43632bp,与禽Ⅰ群腺病毒E基因型CR119株、YR36株、TR59株、764株、HG株、UPM04217株、HLJ/151129株同属一个大的进化分支,核苷酸序列同源性介于93.4%～98.4%之间;QD2016株与UPM04217株亲缘关系最近,同属于FAdV-8b。2 FAdV-4和FAdV-8b二价油乳剂灭活疫苗的研制本研究以FAdV-8b QD2016株和实验室先前分离鉴定的FAdV-4 GX2013株研制二价油乳剂灭活疫苗。根据《中华人民共和国兽药典》的要求建立了两个毒株的种子库,经检验无禽白血病病毒(ALV)和网状内皮组织增生症病毒(REV)等外源病毒的污染。利用细胞工厂培养LMH细胞,用于扩增FAdV-4 GX2013株和FAdV-8b QD2016株。应用SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR的方法,对扩增的病毒进行定量分析;确定扩增GX2013株和QD2016株的最佳感染复数分别为1.2和3.2,适宜的收毒时间均为接毒后72 h。病毒液经终浓度为1‰的甲醛灭活,以白油为佐剂制成油乳剂灭活疫苗。研制的疫苗为油包水剂型,物理性状稳定,无菌检验合格。取7日龄SPF鸡20只,分为2组,每组10只。第1组为免疫组,于颈部皮下接种制备的灭活疫苗,0.5mL/只;第2组为对照组,于颈部皮下接种等剂量的灭菌白油。接种后21 d内免疫组和对照组的鸡精神状况及采食量均正常,剖检未发现接种部位出现损伤、炎症及疫苗残留等现象,表明该疫苗的安全性良好。将7日龄SPF鸡分成6组,每组10只,分别免疫25 μL、50μL、100μL、250 μL和500μL疫苗,以及500μL灭菌白油(对照组)。免疫后21 d,每组各取5只鸡,分别用FAdV-4GX2013 株(105.5 TCID50/mL)和 FAdV-8bQD2016 株(105.5TCID50/mL)经肌肉注射进行攻毒,0.2 mL/只;分别于攻毒后3 d、5 d、7 d和10 d采集试验鸡的咽喉拭子和泄殖腔拭子,应用SYBR Green I实时荧光定量PCR的方法测定病毒含量。结果显示,攻毒后7 d内咽喉和泄殖腔排毒量相继达到高峰,其中25μL、50 μL和100μL免疫组的排毒量与对照组相比差异不显著(P>0.5),250 μL和500 μL免疫组的排毒量与对照组相比差异极显著(P<0.01),而这两个免疫组之间的排毒量差异不显著(P>0.5)。据此推测:疫苗的免疫剂量为250 μL和500 μL/只均能有效阻止排毒,建议的疫苗免疫剂量为250 μpL/只。取7日龄SPF鸡30只,分为3组,每组10只。第1组和第2组为免疫组,每只鸡颈部皮下接种250 μL疫苗;第3组为对照组,每只鸡颈部皮下接种250 μL灭菌白油。第1组的鸡只于免疫后7 d、14 d、21 d、28 d和35 d采血分离血清,分别应用血清中和试验(SNT)和琼脂扩散试验(AGPT)监测抗体消长规律。第2组和第3组的鸡只于免疫后21 d 各取 5 只,分别用 FAdV-4 GX2013 株(106.5 TCID50/mL)和 FAdV-8b QD2016 株(106.5 TCID50/mL)经肌肉注射进行攻毒,0.2mL/只;分别于攻毒后3d、5d、7d和10d采集试验鸡的咽喉拭子和泄殖腔拭子,应用SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR的方法测定病毒含量。SNT结果显示,在免疫后7d可检测到FAdV-4和FAdV-8b血清中和抗体,免疫后21 d均达到峰值(210.7和210.6),以后逐渐下降,到免疫后35 d仍能保持较高水平(210.2和29.9);AGPT结果显示,在免疫后14d可检测到FAdV-4和FAdV-8b抗体,21d抗体阳性率最高(100%和90%),随后开始缓慢下降,AGPT抗体增长规律与血清中和抗体保持一致。攻毒保护试验结果显示,对照组的鸡只在攻FAdV-4GX2013株后3d内全部死亡,免疫组的鸡只表现正常,临床保护率达100%;对照组的鸡只在攻FAdV-8bQD2016株后出现采食量下降、精神沉郁、拉稀等现象,免疫组的鸡只表现正常,免疫组和对照组鸡只的咽喉拭子和泄殖腔拭子中病毒含量差异极显著(P<0.01)。综上所述,研制的二价油乳剂灭活疫苗具有良好的免疫保护效果。