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【目的】： 1.构建携带Tet-on系统调控的人骨形态发生蛋白2（hBMP-2）慢病毒载体，转染骨髓间充质干细胞（BMSCs）后，在强力霉素（Doxycycline，DOX）诱导下检测hBMP-2基因的表达效应。 2.对比海藻酸钠（APA）和含酚基羧甲基纤维素（CMC-Ph）与hBMP-2-GV347-BMSCs形成微囊化后的特性及细胞存活率，探讨两种微囊复合体的优势与劣势，为组织工程修复骨缺损提供新型微囊材料。 【方法】： 1.构建携带可调控系统的hBMP-2慢病毒载体:设计目的基因hBMP-2引物，PCR扩增、纯化后将目的基因hBMP-2定向克隆至携带Tet-on调控系统的GV347载体上，通过酶切后电泳、测序鉴定产物是否成功构建hBMP-2-GV347质粒； 2.制备感受态的E.coli DH5a，hBMP-2-GV347质粒转化、扩增后，与辅助质粒共感染293T细胞，与此同时，用空载的GV347与辅助质粒共感染293T细胞；收集和浓缩慢病毒液，通过药筛法测定两种病毒液的滴度；两种慢病毒载体分别转染293T细胞，在有或无DOX诱导下，用western-blot测定各组细胞内目的基因的表达情况。 3.用hBMP-2-GV347慢病毒、空载GV347慢病毒载体分别转染幼年雄性大鼠BMSCs，得到阳性细胞、阴性细胞，探索转染最佳感染复数（MOI），与嘌呤霉素（Puro）最佳筛选浓度。转染后各组细胞在有或无DOX诱导下，利用CCK8法比较各组细胞转染前后的增殖活性；利用Real-time PCR、Western blot和酶联免疫吸附试验(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测转染后各组BMSCs中BMP-2蛋白及RNA的表达情况； 4.高压静电场成囊装置条件为4.0×103V，针尖离液面25mm，注射器推进速度30mm/h，制备APA微囊复合体，微流体装置内流体速度50μl/min，外流体8ml/min制备CMC-Ph微囊复合体；测定两组微囊复合体的粒径，计算其标准差；两组微囊分别在1000rpm/分钟，2000rpm/分钟，5000rpm/分钟，10000rpm/分钟的速度下离心5分钟，比较微囊完整率；利用FDA/EB染色法测定APA微囊复合体内细胞存活率；利用LIVE/DEAD viability/Cytotoxicity Kit对CMC-Ph微囊复合体内的细胞存活率；比较两组微囊的物理特性与生物相容性。 5.ELISA检测hBMP-2-GV347-BMSCs细胞在CMC-Ph微囊复合体中表达BMP-2情况。 【结果】： 1.PCR后得到目的基因hBMP-2，定向克隆至线性化的携带TeT-on系统调控的GV347质粒上，经酶切后电泳、测序结果证实成功构建携带可调控系统的hBMP-2-GV347质粒。 2.hBMP-2-GV347质粒与辅助质粒共感染293T细胞后，经药筛法测定，获得滴度为3×109/ml的阳性慢病毒浓缩液，空载的GV347质粒与辅助质粒共感染293T细胞后得2×109/ml阴性慢病毒浓缩液。在 DOX诱导下，hBMP-2-GV347慢病毒载体在293T细胞内表达BMP-2蛋白。 3.hBMP-2-GV347慢病毒载体转染最佳MOI值为9，最佳嘌呤霉素筛序浓度为3μg/ml，且转染后的BMSC细胞增殖能力较普通BMSC强，并在DOX诱导下持续稳定表达BMP-2蛋白和RNA。 4.高压静电场化学法所制APA微囊复合体的直径为561.69±68.699μm，微流体法所制CMC-Ph微囊复合体的直径为105.65±15.227μm；经高速离心法对比两组微囊复合复得完整律，可知CMC-Ph微囊复合体机械强度较强。APA微囊复合体内细胞存活率与时间呈负线性相关，并于28天内接0％，CMC-Ph微囊复合体内的BMSCs细胞在CMC-Ph微囊内28天后存活率达50%以上，至第54天仍可观察到存活细胞，相比APA微囊复合体，CMC-Ph微囊复合体的粒径较小，微囊形态均匀，机械强度较APA微囊复合体强，并可在DOX诱导下持续稳定表达BMP-2蛋白。 【结论】： 本研究成功构建携带Tet-on系统调控hBMP-2慢病毒表达载体，转染BMSCs后可持续高效表达BMP-2 RAN及蛋白；hBMP-2-GV347-BMSCs细胞在CMC-Ph微囊复合体内存活率较APA微囊复合体高，且CMC-Ph微囊复合体的粒径大小合适、形态均匀，机械强度较高，并可持续、高效、稳定表达BMP-2蛋白，可为组织工程修复骨缺损提供新型微囊材料。